核因子-κB 受体活化因子配体（RANKL）是肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员，它通过结合核因子-κB 受体活化因子（RANK）介导破骨细胞的成熟和功能。因为骨骼的表面面积相对较大，其微观环境又有益于肿瘤生长，所以骨骼是实体肿瘤（如乳腺癌、前列腺癌和肺癌）转移最常见的部位。骨转移瘤患者中，破骨细胞活性过度增强，导致骨质破坏和流失，从而造成骨骼癌源性疼痛和一系列骨相关事件（SREs），如病理性骨折、高钙血症、脊髓受压，需要放疗或外科手术。RANKL 除了在肿瘤诱导的骨质破坏中发挥作用外，也在骨肿瘤形成和进展中发挥主要作用。RANKL 主要通过破骨细胞介导促肿瘤转移和进展效应，但是它也可以不依赖破骨细胞而直接作用于表达RANK 的肿瘤细胞来增加肿瘤侵袭性和转移能力。RANKL 的药理学抑制剂通过阻滞RANKL 与RANK 的结合来抑制破骨细胞生成和降低破骨细胞的活性。这不仅能预防骨质破坏而且能抑制骨转移瘤进展和延迟新骨转移瘤的形成。狄诺塞麦是RANKL 特异性全人类单克隆抗体，美国食品药品监督管理局（FDA）在2010 年批准狄诺塞麦上市，以帮助骨转移瘤患者预防SREs。本文主要阐述了RANKL 间接和直接促转移机制以及狄诺塞麦的临床最新进展。

RANKL 是RANK 唯一的同源性配体，Tnfsf11基因编码，主要由成骨细胞和骨基质细胞表达产生。RANKL 有2 种存在形式，一种是相对分子质量为40 000 ~ 45 000 的跨膜结合蛋白，另一种是相对分子质量为31 000 的游离型多肽（跨膜结合型的胞外部分在140 或者145 位氨基酸残基位点断裂而形成）。2 种形式均可发挥作用，跨膜结合蛋白活性更强。RANKL 通过结合RANK 介导破骨细胞生成、活性和生存期。RANK 是一种跨膜结合蛋白，主要在成熟的破骨细胞以及破骨细胞前体细胞表面表达^[1]。骨保护素（OPG）是一种可溶性糖蛋白，Tnfsf11b 基因编码，主要由成骨细胞分泌产生。它作为“饵”受体阻止RANKL 与RANK 的结合，从而抑制RANKL介导的破骨细胞生成作用。RANKL、RANK 和OPG的相互作用维持着骨骼稳态，使破骨细胞介导的溶骨活动和成骨细胞介导的成骨活动达到动态平衡。它们的发现揭示了破骨细胞生成的关键分子机制和骨骼重塑的重要生理分子机制。

肿瘤转移到骨骼是一个极其低效而又复杂的过程，原发肿瘤细胞中仅有少部分细胞可以成功定植并产生骨转移瘤病灶。值得注意的是恶性肿瘤患者死亡主要是由于转移和并发症，而不是肿瘤本身^[2]。肿瘤细胞与骨微环境相互作用，激活血管生成基因以及延长自身生存期来提高定植概率。骨转移瘤一旦形成可打破骨骼稳态，扰乱溶骨活动和成骨活动的平衡，导致溶骨增加和/或不正常新骨形成。基于X 线片表现，可将骨转移瘤分为溶骨型、成骨型和混合型。大多数情况下，溶骨和成骨往往共同存在，其中之一占优势。如前列腺癌骨转移瘤一般是成骨性的，而乳腺癌和肾癌一般是溶骨性的。溶骨和成骨与RANKL 的表达水平有一定的关联，RANKL 表达水平越高，则溶骨占优势的可能性越大。RANKL结合RANK 可以促进破骨细胞前体细胞分化形成破骨细胞^[3]。小鼠皮下注射人重组RANKL 发现：小鼠的骨质溶解增加，骨密度和骨量下降^[4]。与此相反，敲除RANK或者RANKL基因的小鼠呈现出严重的骨硬化病和破骨细胞缺失^[5]。前列腺癌动物模型中，同时或者分别抑制成骨细胞和破骨细胞活性时发现：成骨活动和破骨活动以一种协同的方式共同促进肿瘤进展^[6]。实际上，破骨细胞的活动是成骨和溶骨活动的必备前提。这些研究证实RANKL 介导破骨细胞成熟和加强破骨细胞活性，而增强的破骨细胞活性又可进一步促进肿瘤进展。

在肿瘤/骨骼邻近破骨细胞的接触面可观察到RANKL 阳性的骨转移瘤基质细胞^[7]，这种细胞与肿瘤诱导的溶骨相关。骨基质内上调RANKL 的分子机制包括肿瘤相关细胞因子的转录反应，这些因子包括白介素-1（IL-1）、IL-6、IL-8、IL-11、巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）和前列腺素E2（PGE2）^[8]。αvβ3 整合素、CD44 和依赖转化生长因子-β（TGF-β）的信号^[9]均能作用于转移瘤细胞，增强RANKL 表达。肿瘤细胞分泌的PTHrP、IL-1、PGE2、DKK-1 以及上皮生长因子等因子可降低基质和成骨细胞表达OPG，因此RANKL 抑制因子含量相应降低^[10]。肿瘤分泌的生长因子，如成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、骨形态发生蛋白（BMP）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1），又可以促进成骨细胞产生和释放RANKL^[11]。所以，肿瘤侵犯骨骼的作用是RANKL∶OPG 的比值增加（图 1）。早期研究运用共同培养方法证实，体外培养的乳腺癌细胞不表达RANKL，但是能刺激基质细胞RANKL 的表达增加，导致破骨细胞形成增多^[10]。虽然大多数据提示癌细胞本身不表达RANKL，但是已经有报道称原发肿瘤或者肿瘤细胞表达RANKL^[8]，这会直接导致溶骨，促进骨转移瘤形成。运用RANKL启动子/报告基因构图的实时图像分析宿主/肿瘤mRNA 也发现，骨骼微环境能诱导前列腺癌表达RANKL^[12]。Zhang 等^[13]体外实验观察发现癌细胞表达RANKL 能够直接介导破骨细胞生成，而无需任何成骨细胞或者基质细胞，这提示肿瘤表达的RANKL 也许超越基质的作用，更有助于骨转移。检测RANKL 的反应物缺乏特异性也许能够解释上述不同的发现。这些发现提示肿瘤表达的RANKL 进一步增强骨转移瘤的破骨细胞性反应和骨骼定植早期阶段诱发骨溶解是可能的。但是，癌细胞表达的RANKL 和/或OPG 对RANKL 与OPG 比值的相对作用仍然不明确。同时，有必要考虑原发肿瘤RANKL 表达程度也许不能反应骨转移瘤局部病灶RANKL 表达水平，因此用原发肿瘤RANKL 表达水平分析RANKL 与转移瘤预后的关系可能缺乏依据。RANKL 结合于RANK 后，TNF 受体相关因子（TRAF-6）募集于RANK 的胞内区域（图 1）。随后，TRAF-6 激活有丝分裂活化蛋白激酶（MAPLs）产生NF-κB，NF-κB 协同活化的T 细胞核因子-2（NFATC2）激活NFATC1，NFATC1 是特异性破骨细胞系转录因子，促进破骨细胞前体细胞成熟，增强成熟破骨细胞活性以及延长破骨细胞生存期，这进一步增加骨质流失，导致骨质破坏，有利于肿瘤细胞定植骨骼，骨转移瘤进展和局部转移。

图 1

图 1 RANKL 间接促转移机制与“恶性循环”

成熟/活化的破骨细胞可以产生多种骨骼来源的生长因子如TGF-β、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGFs）、骨形态形成蛋白（BMPs）和FGF 等^[13]，这些生长因子可以促进肿瘤细胞生长和迁移，其中TGF-β 可诱导肿瘤细胞进行上皮- 间充质转化（EMT），详见3.1 节。肿瘤分泌的生长因子又可以促进成骨细胞产生和释放RANKL^[11]。因此，溶骨和肿瘤生长迁移形成了骨质破坏“恶性循环”（图 1）。骨微环境中的癌细胞和正常宿主细胞之间的相互作用促发骨转移瘤发展。Weilbaecher 等^[14]认为RANKL 是破骨细胞生成的关键，RANK-RANKL 系统在骨转移瘤形成和进展方面起着重要的作用，它也是阻止和治疗骨转移瘤的一个具有吸引力的治疗靶点。临床前研究已经证实RANKL 抑制剂能显著延迟骨转移瘤形成、减轻骨肿瘤负荷以及延长荷瘤小鼠生存期^[15]。而且，不管RANKL 的来源，药理RANKL 抑制剂均可对抗RANKL。骨转移瘤中，OPG-Fc 或者RANK-Fc的临床前试验支持RANKL 在肿瘤相关破骨细胞生成和溶骨性骨质破坏中起着关键作用。乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌以及结肠癌骨转移瘤模型中，RANKL 的药理学抑制剂能阻止肿瘤相关的骨质破坏^[16]。狄诺塞麦是目前研究得最透彻的特异性抗RANKL 单克隆抗体，机制见图 2。狄诺塞麦特异性结合RANKL，阻断了这种“恶性循环”，可以抑制过度激活的破骨细胞成熟和功能活性，减缓骨转移瘤进展和转移。本文将在综述的后部分详细地讲述其临床疗效。

图 2

图 2 狄诺塞麦特异性结合RANKL抑制“恶性循环”机制

体外和体内研究提示RANKL 能直接作用于表达RANK 的肿瘤细胞来促进远处转移、增加基质金属蛋白（MMP）产量、促进肿瘤细胞增殖和延长肿瘤细胞生存期（图 3）。Jones 等^[17]在骨转移瘤实验模型中发现RANKL 抑制剂能阻滞B16F10 黑素瘤细胞体内转移，B16F10 亚克隆没有刺激产生明显的溶骨反应；其次，与OPG-Fc 相比，二磷酸盐破骨细胞抑制剂没有减少B16F10 骨转移。以上发现均支持RANKL 不依赖破骨细胞而具有直接促转移效应。Tan 等^[18]运用自发转移至肺的原位乳腺癌细胞系也证实在乳腺肿瘤2（MT2）细胞接种到乳腺之后，用RANKL 处理小鼠会增加肺部转移瘤的数目和发生率；敲除MT2 细胞的RANKL 基因能减少肺转移瘤数目和抑制RANKL 反应，这提示RANKL 直接作用于表达RANK 的癌细胞。Gonzalez-Suarez 等^[19]用小鼠乳腺肿瘤病毒-neu（MMTV-neu）转基因小鼠作为检测RANKL 在自发性肿瘤进展和肺转移中作用的模型。RANK-Fc 治疗MMTV-neu 小鼠没有改变乳腺癌形成的平均时间，但是每只小鼠乳腺癌数目减少，并且自发性肺转移瘤数也明显下降。值得注意的是，原发性乳腺癌中，有50% 的雌激素阴性（ER-）/孕激素阴性（PR-）肿瘤表达RANK，而仅有18% 的ER+ /PR+ 肿瘤表达RANK^[20]。可见，ER- /PR- 的肿瘤表达RANK 比ER+ /PR+ 肿瘤更加常见。

图 3

图 3 RANKL 直接促转移机制

大量的体外和体内实验证据解释了RANKL 直接促转移的多种有效性机制。RANKL 的促转移效应和一些与迁移、血管生成和侵袭相关的因子的上调有关。MDA-MB-231 乳腺癌细胞中，RANKL 水平的改变与MMP1、MMP9、MMP 诱导物EMMPRIN /CD47 和VEGF 相关^[21]。前列腺癌PC3 细胞RANKL刺激的转移和侵袭与MMP9、IL-6、IL-8、VEGF 和细胞因子CXCL 家族的一些成员相关^[22]。

最近，EMT 备受关注。RANKL 可以促进肿瘤细胞进行EMT（图 1）。Palafox 等^[20]发现RANK 过表达可诱导乳腺癌细胞系MCF10A 和MDA-MB-436 进行EMT，从而增强MDA-MB-436 乳腺癌细胞肺转移的能力。EMT 期间，肿瘤细胞骨架重排，这使肿瘤细胞之间失去黏附和细胞接触并且细胞获得运动性^[23]。因此，肿瘤细胞的侵袭性和转移能力增强。肿瘤细胞之间接触性下降主要是由于细胞表面黏附分子E- 钙黏附蛋白的表达下降^[24]。TGF-β 也可诱导EMT^[25]。肿瘤转移定植到骨骼之后，又可以进行MET 回到原来的状态，BMP-7 是MET 的主要诱导者^[25]。Bidard 等^[26]发现肿瘤细胞可以重新编程其旁边的非肿瘤形成细胞或者正常的宿主小鼠细胞，使得这些正常细胞呈现出肿瘤细胞样表型，能进行EMT 并定植骨骼。

目前，在小鼠乳腺和人类乳腺上皮中，认识到RANKL 是孕激素有丝分裂作用的主要旁分泌效应因子^[27]。RANK 和RANKL 基因敲除的小鼠在妊娠期发育期间乳腺表现出明显的功能性障碍^[28]。RANKL 蛋白受PR 调节并在ER+ /PR+ 的细胞腔上皮中表达。RANKL 与乳腺增生正相关，并以旁分泌的方式作用于增殖性ER- /PR- 乳腺细胞表面的RANK^[27]。RANKL 能促使大量乳腺上皮细胞进行转化，从而增加了乳腺癌风险。早期RANKL 抑制几乎完全阻止乳腺癌的发生支持这个假说^[29]。这些发现提示RANKL 通过刺激上皮细胞也能直接刺激肿瘤形成和转移进展（图 3）。

乳腺上皮细胞系中，RANK先天性灭活之后，从乳腺肿瘤中分离的Lin-CD24+CD49fhi 干细胞的自我更新能力明显下降，这与运用醋酸甲羟孕酮和7，12- 二甲基苯蒽处理这些小鼠后观察到的乳腺癌发生率整体下降相关^[29]。Palafox 等^[20]运用乳腺RANK过表达实验模型观察到乳腺肿瘤干细胞（CSC）和基底/干细胞标志物表达增加，并且它们的功能效应与增强的干细胞活性相一致。在MCF-10 细胞中，RANK 过表达会增加CD44⁺ 及CD24^- 细胞的数量和小部分细胞表达CD133 或者CD10，表现型标志物和干细胞比例相一致^[30]。这些发现均提示RANKL在正常乳腺CSC 或者早期乳腺上皮祖细胞的增殖和再生潜能中发挥作用，这也提示RANKL 可以通过刺激CSC 影响转移发生（图 3）。

狄诺塞麦是高亲和力结合RANKL的全人类IgG2单克隆抗体，其作用机理见图 2。3 组随机化双盲3期临床试验（n=5 723）综合分析已经证实狄诺塞麦在延迟患者第一次SREs 时间方面的疗效要优于唑来磷酸：狄诺塞麦治疗组第一次SREs 时间平均延迟了8.21 个月，第一次SRE 风险下降了17%^[31]。这3 组临床试验对象分别为乳腺癌患者，前列腺癌患者，其他多种癌症（不包括乳腺癌和前列腺癌）或者多发性骨髓瘤患者。但是，狄诺塞麦治疗组和唑来磷酸治疗组之间，患者的疾病进展和整体生存期没有差别。值得注意的是，研究者对该3 期临床试验进行事后分析发现，在肺癌患者亚组中，与唑来磷酸治疗组相比，狄诺塞麦治疗组能改善整体生存期^{[32, 33]}。这2 个分析有差异的原因主要是上述的临床研究是设计来检测骨骼效应的，而不是用来测试狄诺塞麦的抗肿瘤疗效。因此，可以认为狄诺塞麦可能具有直接抗肿瘤效应，能改善肺癌患者的整体生存期。RANKL 抑制剂直接抑制表达RANK 的肺癌细胞能解释相关机制^[33]。当然，这也可能是由于在肺癌患者中RANKL 抑制剂扰乱骨骼微环境与肿瘤细胞之间的相互作用的程度更大。

2010 年11 月19 日，FDA 批准了狄诺塞麦上市以帮助那些已有骨转移并且有骨质破坏的癌症患者来预防SREs，但是狄诺塞麦在多发性骨髓瘤或者其他血液性肿瘤患者中没有被批准。这正是因为狄诺塞麦在延迟患者第一次SREs 时间方面优效于唑来磷酸，而在其他方面均非劣效于唑来磷酸。并且，狄诺塞麦并不能改善多发性骨髓瘤患者的SREs^[32]。

另一个大型随机双盲对照Ⅲ期临床研究（30 个国家，139 个临床中心，1 432 例患者），狄诺塞麦与安慰剂对照组相比，能延长非转移性阉割抵抗型前列腺癌患者的无骨转移瘤生存期以及能延迟患者第一次骨转移瘤时间^[36]。除了颌骨坏死和低钙血症更常见于狄诺塞麦治疗组外，2 组的不良反应没有差别。这证实了靶向抑制骨骼微环境RANKL 能延迟前列腺癌骨转移瘤的发生和进展，为预防骨转移瘤的发生提供一个可能的新方法。

值得注意的是狄诺塞麦治疗首要的风险是低钙血症，肾功能有障碍者风险会更高。这提示临床运用狄诺塞麦时需要监测患者的血钙浓度以免发生意外。同时，这也提示狄诺塞麦更适合运用于有高钙血症的患者，以及那些原发骨肿瘤产生了高钙血症的患者（如骨巨细胞瘤）。最近，Adhikaree 等^[37]报道狄诺塞麦在二磷酸盐难治性恶性肿瘤高钙血症中也有显著疗效。Arnulf 等^[38]提出运用狄诺塞麦能预防癌症治疗导致的骨质丢失。Santini 等^[39]运用免疫组化方法分析了93 例患者原发肿瘤的RANK 表达水平，发现原发肿瘤RANK 与骨转移瘤发展和缩短的无疾病生存期正相关。这提示原发肿瘤表达的RANK 也许是预测骨转移瘤的标志物，这也为临床医生筛选适合进行RANKL 抑制治疗的患者提供了支持。

机体正常状态下，破骨细胞和成骨细胞的协调活动确保溶骨和成骨的相互平衡。RANKL 介导破骨细胞生成、功能和生存期。骨转移瘤中，RANKL表达水平上升打破骨骼稳态，导致骨质流失。临床研究已经证明RANKL 介导破骨细胞生成与骨转移瘤形成是因果关系。进一步分析肿瘤原发和转移位点RANKL 的水平能明确原发肿瘤RANKL 水平是否能反应转移瘤位点的RANKL 水平提供证据。

RANKL 主要通过2 条途径介导促肿瘤生长、侵袭和转移效应，一条是破骨细胞介导的间接途径，另一条是作用于肿瘤细胞的直接途径，这2 条通路不同但又有重叠。肿瘤细胞与骨骼微环境形成骨质破坏“恶性循环”，进一步阐明RANKL 信号转导途径将有助于发现潜在的治疗靶点。虽然已经明确肿瘤或者干/祖母细胞中表达的RANK 对促进转移是必须的，但是RANKL 的相关来源仍然在探索之中。体外RANKL 直接作用于表达RANK 的细胞促进转移的机制是否能解释体内RANKL 抑制剂阻止远处非骨骼转移瘤也需要进一步明确。

狄诺塞麦作为特异性RANKL 抑制剂可以抑制上述“恶性循环”，减缓肿瘤生长，延迟SREs。许多临床研究已经明确地表明狄诺塞麦能预防多种骨转移瘤患者的SREs，但是并没有发现狄诺塞麦能改善所有类型骨转移瘤患者整体生存期的证据。因此，狄诺塞麦是否能延长乳腺癌和前列腺癌患者的生存期和无疾病生存期需要进一步探索。骨转移瘤患者提倡个体化治疗^{[40, 41, 42]}，进一步探究关键靶点和不同人群的特异性靶点可以为骨转移瘤个体化治疗提供理论支撑。