2. 同济大学纳米研究所, 上海 200092
2. Institute of Nano, Tongji University, Shanghai 200092, China
钛合金因具有良好的弹性模量、耐腐蚀性及生物相容性等优点而成为目前骨科使用最广泛的置入物材料,但是由置入物相关感染造成的内固定失败屡见不鲜。文献报道细菌可于钛合金置入物表面定植形成细菌生物膜[1],而且抗菌药物难以起效,使得置入物相关感染迁延不愈,因此预防感染发生可更好地从源头上解决问题。预防置入物相关感染的重要策略是阻止细菌在初始位置的黏附及增殖,抑制细菌生物膜的形成。本实验通过低温等离子体聚合技术(Plasma),使烯丙胺单体于钛合金表面引发聚合,形成具有“接触性杀菌”性能的聚合氨基阳离子纳米薄膜涂层,再通过物理-化学表征检测、体外及体内抗菌实验对涂层进行验证,初步获得该薄膜的制备方法及抗菌性能。
1 材料与方法 1.1 实验材料用于制备带涂层样品的钛合金材料为枢法模医疗器械公司CD Horizon系统的钛合金棒,激光切割机切割成44段长度50.0 mm、直径5.5 mm的圆柱形棒(24段用于表征检测、20段用于体外抗菌实验);16枚Center-piece螺钉(大小为7.0 mm× 1.6 mm×1.6 mm)用于动物体内抗菌实验。用超声清洗样品,去离子水漂洗后烘干待用。留取22段钛合金棒及8枚螺钉,作为对照组。
1.2 聚合氨基阳离子涂层的制备及表征检测Plasma处理气体的选择及参数的控制参考Labay等[2]的实验方法。将样品置入等离子体设备反应室,先通入50 mL/min(标准状态)氩气,调整放电功率为100 W,处理时间300 s;打开单体气体阀门,通入烯丙胺蒸汽、50 mL/min氩气及50 mL/min氧气组成的混合气体,保持真空室压强在80 Pa,峰值放电功率为100 W,聚合物薄膜沉积时间为1 200 s。破真空结束后,取出反应室内的样品,置于冰箱内冷藏2 h。用场发射扫描电子显微镜(SEM)观察样品的表面形貌、接触角测量仪测量水接触角、X线光电子能谱仪(XPS)分析表面成分含量。
1.3 体外抗菌实验分别进行金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的培养及梯度稀释,使得最终制备的菌悬液活菌数为1×105~ 9×105 cfu/mL。取出4组钛合金棒(每组分别为5个样品)置于平板内;用40.0 mm×5.0 mm大小的无纺布20片分别覆盖于钛棒表面,用微量移液器吸取制备的两种菌液各100.0 μL,将其滴于无纺布上使其完全湿润并紧贴于钛棒表面,置于室温反应24 h后,将4组样品的钛棒连同紧贴的无纺布样片共同加入到含10.0 mL无菌生理盐水的离心管中,剧烈摇晃1 min,洗涤振荡细菌(避免钛棒及无纺布样片细菌残留),取0.1 mL菌液涂于平板,每个样品各涂2个平板,将其置于培养箱中培养24 h后取出并计数。抑菌率(%)=(对照组的活菌数-涂层组的活菌数)/对照组的活菌数×100%。
1.4 动物体内抗菌实验及组织学评估参照Jin等[3]的动物体内抗菌实验方法,在新西兰大白兔(第二军医大学实验动物中心)胫骨的骨髓腔内注入金黄色葡萄球菌,然后置入带涂层的钛合金螺钉或对照钛合金螺钉,观察体内抗菌实验效果。将取出的标本置于4%多聚甲醛进行组织固定,过滤并包埋样品。在切片机(德国EXAKT公司,EXAKT310)上将样品固定牢固,且使刀片切割方向与骨缺损长轴方向垂直,切成厚度为50.0 µm的切片。用黏合剂将切片贴至硬组织专用的有机玻璃载玻片上。玻片用苏木精染色后,于显微镜下观察相应骨组织与置入物周围中性粒细胞浸润情况。
1.5 统计学处理运用Graphpad Prism软件进行数据分析,组间均数的比较采用方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 涂层表征检测结果SEM下可见对照组钛棒表面粗糙,凹凸不平,纹理清晰可辨(图 1a);经Plasma法处理后,原先纹理难以辨认,为一层薄膜所覆盖,可见较多散在分布的颗粒样聚合物(图 1b)。亲水性测试中,对照组钛合金棒表面接触角为100.3°±3.4°(图 1c),为疏水性材料;经由Plasma处理后,接触角下降为13.6°±3.0°(图 1d),差异具有统计学意义(P < 0.05)。XPS测量结果可见对照组氮(N)元素含量为2.75%;经Plasma处理后,表面N元素含量提高至11.8%,N元素含量较对照组明显增加(图 2)。
2组样品对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的平板计数图(图 3)示Plasma涂层组菌落数均明显少于对照组。在金黄色葡萄球菌抑菌实验中,对照组菌落数为(178.7±10.3)个,Plasma涂层组菌落数为(24.8±8.0)个,计算得出Plasma涂层组对金黄色葡萄球菌的抑菌率为(86.1±3.8)%;在大肠杆菌抑菌实验中,对照组菌落数为(220.2±19.2)个,Plasma涂层组菌落数为(53.9±5.6)个,计算得出Plasma涂层组对大肠杆菌的抑菌率为(75.5±2.6)%。经过方差分析发现涂层组对2种细菌均具有明显的抑制作用,与对照组相比差异具有统计学意义(P < 0.05)。
2组样品对金黄色葡萄球菌的体内抗菌实验结果见图 4。在对照组家兔骨髓腔内,螺钉与骨组织周围可见大量中性粒细胞,存在明显的炎性反应。而在Plasma涂层组家兔骨髓腔内,螺钉与骨组织周围仅见极少量中性粒细胞,说明炎性反应不明显。
文献报道脊柱术后感染发生率为0.7%~8.5%[4]。2009年美国疾病预防控制中心则报道椎板切除或脊柱融合手术后的内固定相关感染发生率为3.2%~4.1%[5]。如何有效降低脊柱置入物相关感染引发的内固定及融合失败的风险一直是困扰脊柱外科医师的难题。文献报道椎弓根螺钉在置入人体时,术野的细菌或血液来源中的细菌均可能定植于螺钉表面,继而黏附增殖并形成细菌生物膜[1]。对置入物表面进行改性或负载某些抗菌性能的物质是预防感染发生的可行策略。以银、铜、锌等为代表的无机金属离子抗菌剂可以通过干扰细菌细胞膜的通透性和新陈代谢而发挥广谱抗菌作用,但是其对成骨细胞的毒性作用限制了其在临床中的广泛使用[6-8]。于生物可降解聚合物和无机材料表面负载抗生素是另一种解决途径,例如在钛纳米管中载入庆大霉素[9]、聚乙醇酸-乳酸中载入万古霉素[10]、钙磷酸盐/羟基磷灰石骨支架上载入庆大霉素[11]等,但是,传统抗生素的过度使用会导致细菌耐药性的产生。另外,一些聚合物也被开发用来减少细菌的黏附,如丝胶蛋白固定聚甲基丙烯酸的亲水性聚合物薄膜可以显著减少金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的黏附[12];但是该抗细菌黏附涂层会干扰置入物骨整合过程,从而导致早期内固定失败[13]。本研究利用聚合阳离子破坏细菌细胞膜的“接触性杀菌”抗菌特性,采取Plasma技术,使烯丙胺单体于钛合金表面聚合,引入聚合氨基阳离子,在细菌定植到置入物表面时即刻将其杀死。
Plasma技术是近年来出现的一种对材料表面进行改性的方法,具有成本低、清洁、高效等优点。选择合适的等离子体源能够确保在目标表面引入各种功能团,包括目标基团的共价固定以及各种目标分子的物理吸附,从而改善材料的亲水性、黏附性、生物相容性[14]。Labay等[2]通过Plasma法,成功在聚丙烯高分子材料上获得了氨苄青霉素载药涂层。本实验中选取烯丙胺单体作为等离子体源,使聚合物薄膜在目标材料上沉积。SEM结果发现,对照组表面粗糙,与文献报道一致[15],而经Plasma处理后,可在样品表面观察到散在的球形颗粒,推断为聚合氨基阳离子薄膜。文献报道置入材料表面的亲水性会影响细菌的定植,而水接触角可以直观反映这一特点[16]。本研究中对照组钛合金棒接触角为100.3°±3.4°,疏水性明显,可能与表面的氧化膜及粗糙度比较大有关系。涂层组水接触角大大降低,为13.6°±3.0°,表面的亲水性得到了极大的提高,因为Plasma处理大大降低了材料表面的粗糙度[17]。XPS分析结果显示,经Plasma处理后,材料表面的N元素含量增加明显,这与烯丙胺单体在底物表面发生聚合引入了大量的N元素有关,从而证明聚合氨基阳离子纳米薄膜的成功制备。
关于骨科置入物感染的细菌来源,Campoccia等[18]发现金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌所致的感染分别占所有骨科置入物感染的34%及32%;而王化芬等[19]发现金黄色葡萄球菌仍是首位感染菌,占统计数据的33%,而大肠杆菌作为革兰阴性菌的代表菌,占所有阴性菌感染的52%,且呈逐年上涨趋势。因此本研究选择金黄色葡萄球菌及大肠杆菌来验证聚合氨基阳离子纳米薄膜的抗菌性。抗菌实验结果显示,钛合金表面聚合阳离子薄膜具有抗金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的作用。而随后的动物实验也验证了该薄膜对金黄色葡萄球菌的杀菌能力。此外,聚合阳离子的厚度与其杀菌效果直接相关,金黄色葡萄球菌的细胞膜厚度为45~55 nm,大肠杆菌细胞膜厚度为46 nm,聚合阳离子至少需要75 nm的厚度才能透过细菌细胞膜杀灭细菌[20-21]。因此,聚合阳离子纳米薄膜的厚度及抗菌谱范围需进一步的研究。
本研究目前只是初步的实验探索,该聚合阳离子纳米薄膜的稳定性、成骨细胞毒性等均需进一步的研究,而且本实验只验证了其对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抗感染能力,对其他细菌如厌氧菌、铜绿假单胞菌甚至结核杆菌等的抗菌性能也是下一步实验的重点。
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