青少年特发性脊柱侧凸（AIS）是指冠状位弯曲 > 10°并伴有椎体旋转的一种脊柱三维畸形^[1]。AIS的病因仍然未知，双胞胎研究和家族聚集研究显示遗传作用在AIS的发生过程中起到了重要作用^[2-4]。但截至目前，只有AKAP2基因和POC5基因被证实可以导致AIS^[5-6]。此外，几项全基因组关联研究已经确定GPR126、CHL1和LBX1基因中的单核苷酸多态性（SNP）位点与AIS发生相关^[7-8]。这些研究结果均表明AIS具有遗传异质性。本研究试图通过全基因组测序的方法来探索中国汉族AIS患者中呈复合杂合隐性遗传的致病基因。

招募1个汉族AIS家系。家系的先证者在15岁时被确诊为AIS，她的双胞胎妹妹表现出与先证者相似的侧凸类型，其他家庭成员（父母）没有明显的脊柱侧凸病史。所有家庭成员均拍摄全脊柱正侧位X线片。由2名经验丰富的矫形外科医师独立进行体格检查和病史回顾。AIS定义为脊柱冠状面侧凸曲度 > 10°并伴有椎体旋转，无先天性畸形。本研究经海军军医大学附属长征医院伦理委员会批准，参与研究的家系成员均于研究前签署了书面知情同意书。

使用血液DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德国Qiagen公司）从受试者（先证者及其父母）外周血中提取DNA样品，储存于-20℃冰箱备用。用1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA的完整性并使用Applied Biosystem SOLiD 4.0系统进行全基因组测序（WGS），依据标准SOLiD分析工作流程对主要测序数据进行分析，使用SOAPaligner程序对原始序列读数并与参考基因组（hg19）进行比对。选择非同义（NS）变体、剪接（SS）变体以及插入或缺失（indel）变体3种可能更具致病性的变体类型研究潜在致病突变。调用SNP对候选基因进行优先排序分析，比对读数去除dbSNP、HapMap、1000 Genomes、ESP6500、ExAC以及中国内地外显子数据库（1 500个中国汉族个体）中存在的序列变异^[9]。使用SIFT（sift.bii.a-star.edu.sg/）、Polyphen-2（genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）和MutationTaster（www.mutationtaster.org/）预测有破坏性的单核苷酸变异（SNV）。

使用Primer 5程序（https://frodo.wi.mit.edu/）设计PCR引物，对基因组DNA进行PCR扩增，在ABI 3130 DNA分析仪上进行双向DNA Sanger测序验证所有发现的突变。

本研究纳入了了一个二代家庭，先证者主胸弯Cobb角为46°，于2015年在长征医院接受了矫形手术（图 1a，b），其妹妹具有相似的侧凸，Cobb角21°，未接受治疗，密切临床随访中（图 1c，d），其他家庭成员（父母）没有脊柱畸形表现，AIS在这个家庭中表现为隐性遗传或新发性状（de novo）。WGS在鉴定常染色体隐性遗传方面已被证明非常成功。本研究准备了先证者及其父母3个人的基因组文库，获得了平均深度为38.15×、人均830.87 Mb的序列，测序的数据详见表 1。

图 1

Figure 1

a，b：先证者 c，d：先证者妹妹 a, b:Proband c, d:Proband's sister 图 1 全脊柱X线片 Figure 1 Whole spine roentgenographs

表 1(Table 1)

表 1 WGS数据 Table 1 Data of WGS 样本 Sample 总读数/Mb Total reads/Mb 序列读数/Mb Aligned reads/Mb 序列读数比（%） Percent（%） 外显子碱基数/ Mb Initial bases on exon/Mb 覆盖的碱基数/Mb Bases covered on exon/Mb 测序深度 Sequencing depth 有效碱基比（%） Effective bases on target（%） 目标区域覆盖程度（> 10×）（%） Coverage of target regions（> 10×）（%） 先证者 Proband 847.19 843.50 99.57 77.5 3 049.52 39.35 92.03 97.92 先证者父亲 Proband’s father 856.51 851.31 99.39 77.5 3 026.85 39.06 91.65 98.39 先证者母亲 Proband’s mother 788.92 785.41 99.55 77.5 2 793.92 36.05 94.31 97.88

表 1 WGS数据 Table 1 Data of WGS

将平均99.50%原始序列读数与参考基因组（hg19）进行比对，分析2种模式（隐性遗传或新发性状）可能性，其中新发性状所有识别的突变都呈假阳性，只有复合杂合隐性遗传模式符合该家系遗传模式。先证者存在NS/SS/indel变体，但其父母不存在变体。排除所有数据库中频率 > 0.01%的突变，考虑到大多数致病变体可能影响高度保守的序列和/或被预测为有害，使用SIFT、PolyPhen-2和MutationTaster的预测程序得分来预测变体的功能影响，得到8个基因，其中7个基因在功能上无关而排除（表 2），只有DOCK9基因的2个突变保留作为候选变体：外显子30中的错义突变c.3259T > C（p.F1087L，NM_001130050）和外显子22中的错义突变c.2465A > G（p.Y822C，NM_001130050）。2种突变均通过Sanger测序证实（图 2），并且突变位点在不同物种氨基酸水平上高度保守（图 3）。在该家系中，先证者DOCK9基因中存在该复合型杂合突变，经验证，其妹妹的DOCK9基因中也存在该复合型杂合突变，而未发现既往报道的基因突变（POC5、AKAP2）。其母携带错义突变p.F1087L，其父携带错义突变p.Y822C，据此推测DOCK9突变基因很可能是AIS的发生原因。

表 2(Table 2)

表 2 WGS排除基因 Table 2 Excluded gene of WGS 基因 Gene 全称 Whole name 变体 Variants 功能 Function 破坏性预测 Damage prediction ABCA10 三磷酸腺苷结合盒亚家族A成员10 Adenosine triphosphate binding cassette subfamily A member 10 c.2150_2151del：p.Q717fs； c.871G > T：p.D291Y 与三磷酸腺苷结合 Adenosine triphosphate binding 破坏 Damaging OR1L3 嗅觉感受器家族1亚家族L成员3 Olfactory receptor family 1 subfamily L member 3 c.95T > C：p.L32P； c.328_331del：p.I110fs 与气味分子结合 Interact with odorant molecules in the nose 可能具有破坏性 Possibly damaging LAMα5 层粘连蛋白α5 Laminin α5 c.6952G > A：p.E2318K； c.5624C > T：p.P1875L； c.3028G > C：p.V1010L 与整合素结合 Integrin binding 可以接受的破坏性 Tolerated damaging LRP2 低密度脂蛋白受体相关蛋白2 Low density lipoprotein receptor related protein 2 c.11321C > T：p.S3774L； c.4733G > A：p.R1578H 突变可能导致Donnai-Barrow综合征 Gene mutations cause Donnai-Barrow and facio-oculo-acoustico-renal syndrome 破坏 Damaging CDAN1 Codanin 1 c.3524G > A：p.C1175Y； c.2591G > A：p.R864Q 维持细胞核膜的完整，突变可能导致红细胞生成异常 Maintaining nuclear envelope integrity. Gene mutations cause erythropoietic abnormality 破坏 Damaging TIAM2 T细胞淋巴瘤浸润和转移蛋白2 T-cell lymphoma invasion and metastasis-including protein 2 c.1042G > A：p.G348R； c.2860C > T：p.L954F 谷胱甘肽过氧化物酶激动剂 Glutathione peroxidase agonist 可以接受的破坏性 Tolerated damaging NOBOX 同源盒蛋白NOBOX NOBOX oogenesis homeobox c.1034C > T：p.S345L； c.487C > G：p.R163G 在卵子发生中发挥作用 Play a role in oogenesis 无破坏性 Benign

表 2 WGS排除基因 Table 2 Excluded gene of WGS

图 2

Figure 2

a：c.3259 T > C（p.F1087L）突变 b：c.2465 A > G（p.Y822C）突变 箭头示突变位点 a:c.3259 T > C(p.F1087L) mutation b:c.2465 A > G(p.Y822C) mutation Arrows indicate mutation site 图 2 Sanger测序验证DOCK9突变 Figure 2 Sanger sequencing for verifying DOCK9 mutation

图 3

Figure 3

图 3 突变位点在不同物种之间具有高度保守性 Figure 3 Mutation sites with highly evolutionary conservation between multiple species

AIS的病因尚不明确，但是既往的流行病学研究显示，直系亲属中存在AIS患者，AIS发生风险较高，而且在双胞胎研究中，同卵双胞胎同时出现脊柱侧凸表型的比例（73%）明显高于异卵双胞胎（36%）^[10]，表明遗传因素在AIS发生过程中起到关键作用。近年研究已证实AKAP2、POC5为AIS的致病基因^[5-6]，GPR126、CHL1和LBX1基因也与AIS发生相关^[7-8]。但是这些基因只能解释少部分AIS患者的发病机制，还有大部分患者的发病原因不能用已经报道的突变基因解释。

本研究对1个汉族AIS双胞胎家系进行了探究，通过测序发现，位于DOCK9基因30号外显子的错义突变c.3259T > C（p.F1087L）和位于DOCK9基因22号外显子的错义突变c.2465A > G（p.Y822C）可能是该家系AIS发生的原因。该家系中的2名患者在DOCK9基因中都存在该复合型杂合突变，先证者父亲仅携带p.Y822C突变，其母仅携带p.F1087L突变。DOCK9基因位于13号染色体长臂32.3区域，有61个外显子。其编码的DOCK9蛋白属于Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子，通过将鸟苷二磷酸转化为鸟苷三磷酸而激活Rho鸟苷三磷酸酶，进一步调控细胞的迁移、极性，细胞骨架的组装以及细胞凋亡^[11]。DOCK9可特异性地与cdc42结合形成复合体。Choi等^[12]研究发现，cdc42基因敲除的斑马鱼模型出现脊柱侧凸的表型；而对斑马鱼进行解剖发现，其神经管内的纤毛发育异常。纤毛是一类传递化学及机械信号的细胞器，在人类组织中（除血细胞）广泛存在。Grimes等^[13]研究发现，ptk7基因突变的斑马鱼室管膜细胞纤毛发育和脑脊液循环出现障碍，表现出类似于AIS的表型，证实ptk7基因突变斑马鱼是研究AIS的理想动物模型，也为纤毛功能障碍在AIS的发生中发挥重要作用提供了证据。此外，Baek等^[14]已经证明，Tuba蛋白的缺乏可导致斑马鱼纤毛发育障碍，出现脊柱畸形的表型，而Tuba与DOCK9具有相同的功能。Oliazadeh等^[15]研究发现，AIS患者成骨细胞纤毛长度较正常人的成骨细胞长，而纤毛的长度与信号转导的强弱有关；因此，也认为纤毛的功能异常在AIS的发生过程中起关键作用。因此，本研究组推测DOCK9-cdc42途径可能在纤毛发育中起关键作用，而其通路异常可能导致脊柱弯曲，出现AIS表型。下一步将继续围绕DOCK9在纤毛发育中的具体作用进行深入的机制研究。

总之，本研究首次发现AIS患者家族中DOCK9基因突变的存在，并且以复合型杂合隐性方式遗传给后代。今后需要构建动物模型对DOCK9在纤毛发育中的具体机制进行深入探讨，以解释DOCK9基因突变在AIS发生机制中的作用。