椎间盘退行性疾病可引起疼痛、神经损伤以及劳动力丧失，给社会带来沉重的负担^[1-2]。椎间盘退行性变可导致蛋白聚糖的丢失、细胞外基质结构的破坏、纤维环的撕裂、髓核的突出以及椎间隙高度的丢失^[3]。纤维环无血管及神经，细胞的自我修复能力很差^[4]，一点小的撕裂或裂缝就可能逐渐发展，引起髓核突出或者被椎间盘碎片取代形成瘢痕；外科手术可以清除游离的纤维环碎片和髓核，但是撕裂的纤维环得不到有效修复，可能引起复发或出现继发病变^[5-7]。因此，有效修复纤维环具有重要的临床意义。

组织工程技术为纤维环修复提供了新思路，如何根据纤维环复杂的结构和力学特点构建“仿生”生物支架是研究的难点。纤维环所受应力复杂，内部胶原纤维高度取向、交织排列，具有明显各向异性的力学特点。为了模拟该特点，本研究通过多层结合的方法，采用静电纺丝技术制备了取向纳米纤维支架(AFS)、取向纳米纱支架(AYS)和三维多孔纳米纤维支架(3DPS)，并通过体内外实验评价3种支架的生物相容性，为进一步的体内实验奠定基础。

DMEM细胞培养基(Hyclone公司，美国)、胎牛血清(Gibco公司，美国)；CCK-8试剂盒(Dojindo研究所，日本)；明胶、聚左旋乳酸(PLLA)和聚己内酯(PCL)由东华大学提供。倒置显微镜(Olympus公司，日本)；扫描电子显微镜(SEM，飞利浦公司，荷兰)；FL800酶标仪(Bio-Tek公司，美国)。SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)由海军军医大学基础医学院解剖学教研室提供。6周龄雄性SD大鼠24只，体质量约为200 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK(沪)2018-0006。

将PLLA/PCL和明胶按质量比8:2配制成完全透明的溶液，加入注射器中，注射器针头与直流电高压发生器相连(电压12 kV)，用微量注射泵控制溶液的推进速度(1.5 mL/h)，采用高速滚轴作为接收装置，使用共轭静电纺丝技术制备AYS。将PLLA和明胶按质量比2:8配制成溶液，采用常规静电纺丝技术制作无规纳米纤维(电压12 kV，流速2.5 mL/h)，通过改变接收装置，制备AFS。将无规纳米纤维膜剪碎，加入叔丁醇溶液，匀浆打碎，冷冻干燥后成形制成3DPS。将制备的3种支架喷金后采用SEM观察支架形态特征。

将3种支架采用⁶⁰Co辐照消毒后置于24孔板中，使用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基孵育过夜。采用CCK-8试剂盒检测支架中细胞黏附和增殖情况。将第3代BMSC按1×10⁵/孔接种至预置支架的24孔板中，加入含10%胎牛血清的完全培养基，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。分别于培养2、4、8、16 h后去除培养基，PBS轻柔清洗2遍，加入含10%体积CCK-8试剂的无血清培养基继续孵育2 h，随后从每孔培养液中吸取100 μL溶液加入96孔板中，用酶标仪检测450 nm处的光密度(OD)值，每个浓度梯度设置5个复孔取平均值，OD值即反映支架中黏附细胞数目。同法检测细胞在支架中培养1、3、7 d时的增殖情况。7 d后取出支架，固定、脱水、喷金后用SEM观察细胞形态及生长情况。

将3种支架切割成直径约为8 mm的圆盘形，消毒灭菌。SD大鼠麻醉后在背部椎旁1 cm对称做长约1 cm纵行切口，钝性分离皮下组织形成“皮袋”，每只大鼠制作3个“皮袋”，将3种支架分别随机选择一个“皮袋”植入。术后大鼠生命体征平稳，无死亡，苏醒后活动自如，常规饲养，切口愈合良好，无红肿、破溃，1周后拆线。术后1、2、4、8、12、24周，每个时间点随机选取3只大鼠，取出支架进行检测。采用HE染色观察支架形态、炎性细胞长入情况、细胞密度和巨噬细胞融合情况；提取RNA，利用实时荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)基因相对表达水平。

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例数和百分数(%)表示，组间比较采用χ²检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

AFS具有较好的取向性，纤维直径均匀，孔隙较为致密(图 1a)；AYS同样具有良好的取向性，由高度有序排列的纳米纱纤维和少部分散在的纳米纤维构成，纤维之间相互连接，其纤维排列取向性较AFS更佳，具有更高的孔隙率(图 1b)；3DPS排列杂乱无章，但较AFS和AYS具有更高的孔径及孔隙率(图 1c，d)。

图 1

Figure 1

a:AFS  b:AYS  c, d:3DPS 图 1 支架材料的结构(SEM) Figure 1 Structures of scaffold materials(SEM)

BMSC和支架共培养2、4、8、16 h后，3种支架细胞黏附量随时间延长增加。4 h时AFS与AYS、AYS与3DPS的细胞黏附量差异无统计学意义(P > 0.05，图 2)。3DPS的细胞黏附量高于AFS且差异具有统计学意义(P < 0.05，图 2)。8 h时3DPS的细胞黏附量高于AFS和AYS，差异有统计学意义(P < 0.05，图 2)。16 h时3种支架的细胞黏附量差异均无统计学意义(P > 0.05，图 2)。

图 2

Figure 2

注：* P < 0.05 Note:* P < 0.05 图 2 细胞黏附情况 Figure 2 Cell adhesion

BMSC和支架共培养1、3、7 d后，3种支架细胞增殖量随时间延长而增加。1 d时AFS的细胞增殖量与AYS差异无统计学意义(P > 0.05)，而3DPS的细胞增殖量低于AFS和AYS且差异有统计学意义(P < 0.05，图 3)。3 d时AFS的细胞增殖量与AYS差异无统计学意义(P > 0.05)，而3DPS的细胞增殖量高于AFS且差异有统计学意义(P < 0.05，图 3)，3DPS的细胞增殖量与AYS差异无统计学意义(P > 0.05)。7 d时AFS的细胞增殖量与AYS差异仍无统计学意义(P > 0.05)，而3DPS的细胞增殖量高于AFS和AYS且差异有统计学意义(P < 0.05，图 3)。

图 3

Figure 3

注：* P < 0.05 Note:* P < 0.05 图 3 细胞增殖情况 Figure 3 Cell growth

BMSC和支架共培养7 d后，SEM观察可见BMSC在3种支架表面贴附牢固，生长状态良好。在AFS和AYS上细胞随纤维方向生长呈现长梭形，伸展充分(图 4a，b)；在3DPS上细胞多呈圆形，还可观察到细胞向支架材料内部长入(图 4c)。

图 4

Figure 4

a:AFS  b:AYS  c:3DPS 图 4 细胞形态(SEM) Figure 4 Cell morphology(SEM)

支架植入大鼠皮下1周时，AFS表层炎性细胞多，AYS有部分炎性细胞浸润，3DPS炎性细胞浸润较为均匀；2周后3种支架均有炎性细胞浸润，细胞数量显著增多，达到高峰；4周时3种支架上炎性细胞聚集成簇；8周、12周时3种支架材料上炎性细胞数量均减少，部分材料吸收；24周时可见散在的炎细胞浸润，材料稀疏(图 5)。

图 5

Figure 5

图 5 支架植入大鼠体内后的炎性反应(HE染色) Figure 5 Inflammatory response of scaffolds in vivo (HE staining)

支架植入大鼠皮下1周时，AFS、AYS表层炎性细胞多，有零星异物巨噬细胞，3DPS以炎性细胞浸润为主，罕见异物巨细胞；2周、4周时3种支架上均可见异物巨细胞，且AFS、AYS上异物巨细胞显著增多，巨噬细胞聚集、融合成簇，达到高峰，3DPS上异物细胞相对较少；8周时3种支架上炎性细胞和异物巨细胞数量均减少(图 6)。

图 6

Figure 6

图 6 支架植入大鼠体内后的异物巨细胞形态(HE染色) Figure 6 Foreign body giant cells morphology of scaffolds in vivo(HE staining)

支架植入大鼠皮下1周时，3种支架中IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β基因总体表达量均不高，AFS、3DPS中IL-6基因表达量较AYS高，差异具有统计学意义(P < 0.05，图 7a)。2周时3种支架中IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β基因表达量均升高，AFS与3DPS的IL-6基因表达量均较AYS高，差异具有统计学意义(P < 0.05，图 7a)；TNF-α、IL-10、TGF-β基因表达量总体呈AFS > AYS > 3DPS(图 7b~d)。4周时3种支架中IL-6、TNF-α基因表达量明显回落；IL-10、TGF-β基因表达量持续升高达峰值，总体趋势仍呈AFS > AYS > 3DPS 3种支架周表达量差异均有统计学意义(P < 0.05，图 7c，d)。8周时IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β基因表达量均明显回落(图 7)。

图 7

Figure 7

a:IL-6  b:TNF-α  c:IL-10  d:TGF-β  * P < 0.05 图 7 炎性因子基因表达 Figure 7 Gene expression of inflammatory factors

一种合适的纤维环组织工程支架首先需具有良好的生物相容性，将细胞与支架共培养后观察细胞在支架上的黏附、增殖及生长状态是评估支架体外生物相容性的常用方法。本研究结果显示，细胞在3种支架上均良好黏附、增殖，其中在3DPS上细胞黏附率(4、8、16 h)和增殖率(3、7 d)均高于AFS和AYS。SEM观察发现，BMSC在3种支架表面黏附牢固，生长状态良好，且在3DPS上还可观察到细胞向支架内部长入的现象。

支架的生物相容性是支架植入后宿主生理环境和一系列复杂生物、免疫反应的综合结果^[8]，因此，单纯的体外评价并不能准确评估支架的生物相容性，还需要应用动物体内实验来全面评估^[9-10]。支架植入体内后首先被巨噬细胞识别，并黏附于支架表面与其发生相互作用，发生无菌性炎性反应，巨噬细胞与支架逐渐相互融合形成异物巨细胞，因此，巨噬细胞和异物巨细胞是判断支架生物相容性的重要因素^[11]。本研究组织学检测结果表明，3种支架植入大鼠皮下均产生了一定程度的炎性反应，但无皮肤破溃、坏死等明显排斥反应。

本研究还观察了3种支架植入大鼠皮下后炎性因子的表达变化。有研究表明，IL-6、TNF-α通过细胞激活和趋化促进巨噬细胞浸润而促进炎性反应，而IL-10、TGF-β则被认为是抗炎因子^[12-16]。细胞因子在支架植入早期(通常在第1周)即产生并激活，而且是判断针对异物纤维修复预后的重要预测因素^[17-19]。起初血清蛋白、中性粒细胞、单核细胞聚集包裹在支架周边，并激活大量的巨噬细胞黏附于支架上，巨噬细胞分泌特有的细胞因子与支架结合，并成为促炎或抗炎因子的主要来源^[20-21]。通常认为IL-6、TNF-α于急性炎性反应早期出现，在常规伤口愈合过程中，IL-6在伤后1 d开始升高，3 d达到高峰，10 d后回归正常^[22]。本研究发现支架植入大鼠皮下后，这种炎性反应的发生明显推迟，IL-6、TNF-α呈缓慢升高趋势，2周达到高峰，4周后逐渐回落，8周后趋于正常；而IL-10、TGF-β持续升高。炎性因子的表达与组织学检测结果吻合，证实3种支架均可引起轻度慢性炎性反应。

综上，BMSC在AYS和3DPS上增殖、分化良好，且可长入3DPS内部；支架周围组织炎性反应小，提示AYS和3DPS生物相容性良好，为进一步采用AYS仿生外层纤维环、3DPS仿生内层纤维环，两层胶联制成复合支架构建仿生组织工程纤维环奠定基础。