2019, Vol.17 
Issue(3): 220-224
具有调控基因表达作用的非编码RNA(ncRNA)参与调控椎间盘细胞内众多的病理生理过程，在椎间盘退行性变的发生发展过程中起重要作用[1-2]。微小RNA(miRNA)是一种短链小分子ncRNA，miRNA通过与靶基因mRNA的3' UTR结合，阻碍mRNA的翻译或诱导其降解，从而负向调控椎间盘细胞的凋亡与增殖、细胞外基质生成以及细胞自噬等生物学过程[3-5]。同属于ncRNA的长链ncRNA(lncRNA)在发生不同程度退行性变的椎间盘组织中呈差异性表达，参与了对椎间盘内髓核细胞的凋亡与增殖、细胞外基质的降解等多种生理过程的调控[6-7]。目前通过测序技术和基因芯片技术筛选出髓核细胞内差异性表达的lncRNA达2 000多种，且lncRNA的分子结构及作用机制都较miRNA复杂，这可能是lncRNA参与椎间盘退行性变的具体机制尚未完全明确的重要原因[8]。近年，随着研究技术及方法的改进，有关lncRNA调控椎间盘退行性变的具体机制的研究取得了一些进展，故本文对lncRNA与椎间盘退行性变的相关研究作如下综述。
1 lncRNAlncRNA是一种内源性、长度超过200个核苷酸的非编码转录产物，其转录失衡或结构变异与很多疾病的发生发展有着密切的联系[9]。研究发现，lncRNA可通过在表观遗传水平、转录水平和转录后水平等多个层次上调控基因的表达而参与细胞内复杂多变的生物学过程[10]。lncRNA较长的核苷酸链和复杂的空间结构，具备多个位点，可与蛋白质直接结合，或与DNA、RNA之间通过碱基互补配对原则发生特异性的相互作用，形成由lncRNA参与的复杂而精确的基因表达调控网络，从而参与细胞增殖与分化、维持多能性和凋亡抑制等过程的调控[11-12]。lncRNA具有不同的亚细胞定位，在细胞质、细胞核及细胞器内均有分布，其分子功能和作用机制与自身所在位置密切相关，故不同细胞组分中的lncRNA可通过不同的作用方式或分子机制参与调控机体内众多的生物学功能，从而影响疾病的发展及预后[13]。
2 lncRNA与椎间盘退行性变lncRNA已被证实参与多种组织细胞的基因转录、染色质修饰、细胞凋亡、蛋白与蛋白或蛋白与RNA相互作用等生物学过程的调控[14-16]。而椎间盘退行性变是遗传因素、生物力学、营养供应及细胞凋亡等内外因素共同参与，引起组织、细胞、蛋白分子以及基因等不同水平发生病理性改变的复杂过程[17-18]。在基因水平上，lncRNA在椎间盘组织中呈差异性表达，可通过特定的分子机制调控基因的表达进而影响髓核细胞的增殖与凋亡、细胞外基质的改变等生理过程，在椎间盘退行性变的进程中发挥着重要作用[6, 19]。
2.1 lncRNA差异性筛选及生物信息学分析当前lncRNA与椎间盘退行性变的相关研究主要包括lncRNA差异性筛选和机制研究两个方面。通过基因芯片技术或测序技术从发生不同程度退行性变的椎间盘组织中获取lncRNA的表达信息，再利用生物信息技术对lncRNA芯片或测序的结果进行分析，筛选差异性表达的lncRNA、预测靶基因和信号通路、构建共表达网络以及预测lncRNA的功能，为后续的功能验证和机制研究提供有力的科学依据[20]。
临床上常采用Pfirrmann分级[21]系统评估椎间盘退行性变的程度，该系统可以较好地反映椎间盘组织在细胞水平甚至基因水平上的退行性变程度[22]。一般可通过以下3种途径从不同Pfirrmann分级的椎间盘组织的髓核细胞内筛选差异性表达的lncRNA。①利用基因芯片技术获取样本基因表达信息，通过生物信息技术分析芯片结果，筛选差异性表达的lncRNA。Wan等[7]利用lncRNA-mRNA芯片技术筛选并通过荧光定量PCR验证了lincRNA-SLC20A1-1、RP11-296A18.3，KB-1683C8.1、CASP8和FAF1在退行性变椎间盘中明显上调，而RP11-296A18.3和FAF1的表达在退行性变椎间盘中存在相关性，且FAF1可与Fas形成凋亡复合物，故可推断RP11-296A18.3在调控髓核细胞凋亡过程中发挥着重要作用。孙中仪等[8]也利用lncRNA-mRNA技术在退变的椎间盘组织中筛选出上调最显著的3个lncRNA，分别为HOTAIR、UCAI和BCYRNI，而下调较为明显的有H19、MALAT1和NKILA。利用基因本体论(GO)分析发现大多差异性表达的lncRNA都参与了细胞外基质的生成和细胞凋亡过程。②通过测序技术获取发生不同程度退行性变的椎间盘组织中lncRNA表达信息，运用生物信息学技术分析并筛选差异性表达的lncRNA。Zhao等[23]通过RNA测序技术筛选出1 854个lncRNA和2 804个蛋白编码基因在退行性变椎间盘组织中呈差异性表达，其中NONHSAT031859，ENSG00000103855和CALHM2是上调最明显的3个，而下调最明显的3个lncRNA为NONHSAT006310，XLOC027116和IL10RA。利用生物信息学技术预测了这些差异性表达的lncRNA参与调控细胞生长代谢、细胞外基质的生成等多种细胞生理过程。③利用生物信息学技术直接分析从公共数据库获取的芯片或测序信息，筛选出差异性表达的lncRNA，随后可进行功能验证和机制研究。Chen等[24]从芯片数据库(Gene Expression Omnibus database)中获取芯片信息，通过建立lncRNA-mRNA共表达网络发现linc00917和CTD-2246P4与基因SPHK1和UBA52之间存在密切相关性，然后进行GO分析和Pathway信号通路富集分析后发现linc00917和CTD-2246P4参与了蛋白质代谢、细胞迁徙以及神经新生血管形成等生理过程。
2.2 LncRNA调控椎间盘退行性变的机制 2.2.1 作为内源性竞争RNA(ceRNA)吸附miRNAlncRNA的分子机制较为复杂，当前研究关注较多的还是lncRNA可作为天然的miRNA海绵或与其他RNA转录体竞争特定的miRNA，在转录后水平上间接调控miRNA参与的生物学过程[26-27]。lncRNA作为ceRNA也可参与椎间盘退行性变的调控，其相互作用的方式：①与miRNA的种子序列结合形成作用复合体，降低细胞内参与调控下游基因miRNA的数量，促进其靶基因的表达进而调控髓核细胞的增殖与凋亡以及细胞外基质的生成过程[27]。Wang等[28]研究发现，RP11-296A18.3通过竞争性吸附miR-138促进其相邻的编码基因HIF1A的表达，而HIF1A与髓核细胞的增殖以及细胞外基质的合成有关，故HIF1A的表达上调可促进髓核细胞的增殖以及细胞外基质的合成。Xie等[29]的研究发现，HCG18在髓核细胞中表达上调并且可以竞争性吸附miR-146a-5p，促进miR-146a-5p的靶基因TARF6的表达，进而通过NF-κB信号通路阻碍髓核细胞增殖进入S期，在诱发其凋亡、巨噬细胞募集以及成骨分化方面都起到关键作用。Tan等[30]研究发现，SNHG1通过竞争性吸附miR-326阻碍细胞周期蛋白1(CCND1)基因的表达，进而影响髓核细胞的增殖。②与miRNA竞争结合靶基因mRNA的3' UTR，间接抑制miRNA对靶基因的负向调控[31]。Wang等[32]研究发现lncRNAH19与miR-22靶基因LEF1的3' UTR结合，占据miR-22与靶基因LEF1的作用位点，阻碍miR-22参与调控由H2O2诱导的髓核细胞衰老及细胞外基质形成过程。
2.2.2 与特定蛋白结合，诱导染色质重塑lncRNA可通过招募染色质或组蛋白修饰相关蛋白形成作用复合体，到达目标位点并促使该位点上的基因发生表观遗传修饰来调控下游基因的表达[33-34]。而表观遗传往往是通过DNA甲基化、组蛋白修饰和染色体构象的改变，使基因的表达发生可遗传的变化而核苷酸序列保持不变的调控过程[35]。其中组蛋白的乙酰化或甲基化等共价修饰可使染色质活性发生改变，从而促进或抑制基因转录，调节邻近或远端基因的表达[36]。染色质重塑则是以染色质构型改变为基础的表观遗传学机制，主要涉及核小体的结构及其与DNA序列相对位置的改变，通过改变DNA调控序列与启动子的亲和性调控相关基因的表达[37-38]。研究发现linc-ADAMTS5通过与RNA结合蛋白SFPQ结合形成ncRNA复合物，进而调控转录因子Ras反应原件结合蛋白1(RREB1)靶向定位于ADAMTS5的启动子诱导染色质的重塑，招募组蛋白去乙酰化酶HDACs来限制ADAMTS5的表达[39]。由此可见lncRNA在髓核细胞中可通过与特定蛋白结合形成作用复合体，诱导组蛋白修饰和染色质构象改变参与表观遗传修饰，进而调控椎间盘退行性变过程。
2.2.3 直接参与信号通路从lncRNA分子功能上看，其可作为转录因子在转录水平直接或间接地与靶基因相互作用，调控靶基因的转录过程。过表达或者沉默某些lncRNA时会引起相关细胞表型的改变，同时伴有信号通路上的基因、蛋白的差异性改变，说明lncRNA可以通过参与某些信号通路调控细胞增殖、凋亡以及衰老等过程[40]。Chen等[41]研究显示，沉默lncRNATUG1可引起髓核细胞内Wnt、β-catenin表达下调，MMP3、ADAMTS5等细胞外基质退行性变的相关基因以及Caspase-3、Bax等凋亡相关蛋白的表达也显著下调，即通过Wnt-β-catenin信号通路抑制髓核细胞凋亡、衰老，同时参与改善肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的细胞外基质代谢失衡等生物学过程的调控。此外，lncRNAFAF1也参与了椎间盘退行性变的过程，可通过Erk信号通路延长髓核细胞周期中的S期，促进细胞增殖[42]。Ruan等[43]的研究发现，lncRNANEAT1可通过MAPK-ERK1/2信号通路参与髓核细胞外基质的降解过程，进而加速椎间盘组织的退行性变。以上研究证明，lncRNA可通过相关信号通路参与髓核细胞的增殖与凋亡、细胞外基质的代谢等生理过程而调控椎间盘退行性变，但lncRNA与其靶基因相互作用的分子机制还需通过双荧光素酶报告基因检测系统进一步研究证实。
lncRNA自身结构的复杂性决定了其分子功能的多样性。除了上述研究所涉及的分子功能之外，lncRNA还可通过阻碍RNA聚合酶Ⅱ的募集、干扰剪接体识别剪接位点或者通过形成双链RNA而被酶解成内源性小干扰RNA(siRNA)等作用方式干扰下游蛋白编码基因的转录和翻译过程[6, 43]。但这些lncRNA分子功能是否也在椎间盘退行性变的调控中发挥重要作用尚需进一步研究证实。
3 结语与展望当前研究仅着眼于lncRNA参与调控髓核细胞的增殖与凋亡、细胞外基质的生成与降解等生理过程。然而椎间盘的退行性变是个多因素参与的复杂病理改变过程，除了细胞凋亡与增殖、细胞外基质生成与降解，细胞自噬、血管神经生成、氧化应激等在椎间盘退行性变过程中也发挥着重要作用[2, 44-45]。Xia等[46]研究发现，lncRNA也参与调控众多细胞的自噬、氧化应激过程，如lncRNAFLJ11812可竞争性结合miR-4459，调控其靶蛋白自噬相关蛋白13(ATG13)的表达，从而参与人胚胎干细胞的自噬过程。而使用siRNA沉默老化的间充质干细胞中的lncRNAP21，可通过Wnt-β-catenin信号通路增强细胞增殖和旁分泌功能，减弱细胞的氧化应激过程，从而在间充质干细胞的增殖过程中发挥重要作用[47]。目前，有关lncRNA是否参与调控椎间盘细胞的自噬及氧化应激过程尚不清楚，故lncRNA与椎间盘细胞自噬与氧化应激的关系也可成为今后研究的方向。再者，既往研究也证实椎间盘内纤维环细胞及终板细胞的生理改变也会影响椎间盘的退行性变过程[3, 48-49]，因此，未来研究的重点也可放在lncRNA参与纤维环细胞和终板细胞的生物学改变的作用机制上。在基因水平上明确lncRNA调控椎间盘细胞众多生物学过程的具体机制后，这些异常表达的lncRNA也有希望成为椎间盘退行性疾病新的诊断和判断预后的生物学标志物，给临床上腰椎退行性疾病的治疗提供新的思路。
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