脊柱外科杂志  2019, Vol.17 Issue(4): 257-261   PDF    
微RNA-218通过抑制RUNX2及Ⅰ型胶原基因表达延缓后纵韧带骨化
吴深深, 薛敏涛, 孙柏峰, 徐辰, 魏磊鑫, 钟华建, 张子程, 刘洋, 叶晓健, 袁文     
海军军医大学附属长征医院骨科, 上海 200003
摘要: 目的 探讨微RNA-218(miRNA-218)对后纵韧带骨化症(OPLL)患者原代后纵韧带细胞骨化的影响及其作用机制。方法 原代培养5例OPLL患者及5例非OPLL者的韧带细胞,比较2组细胞miRNA-218的表达差异。利用agomir过表达或antagomir抑制OPLL患者韧带细胞中miRNA-218的表达水平后进行成骨诱导,通过检测茜素红染色水平、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因的表达验证miRNA-218对韧带细胞骨化的作用。采用Target scan预测miRNA-218的靶基因,并采用双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-218的靶向作用。结果 OPLL患者韧带细胞miRNA-218的表达水平低于非OPLL者,差异有统计学意义(P < 0.05)。过表达miRNA-218后OPLL患者韧带细胞茜素红染色水平、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因的表达均低于对照组;抑制miRNA-218后OPLL患者韧带细胞茜素红染色水平、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因的表达均高于对照组;差异均有统计学意义(P < 0.05)。Target scan预测miRNA-218靶基因可能为RUNX2和Ⅰ型胶原(COL1A1),双荧光素酶报告基因实验显示miRNA-218能降低RUNX2COL1A1基因的荧光素酶活性水平。结论 miRNA-218能明显抑制原代后纵韧带细胞的骨化反应,其作用机制与抑制RUNX2COL1A1基因表达相关。
关键词: 微RNAs     椎间盘退行性变     骨化, 后纵韧带    
MicroRNA-218 delay ossifcation of posterior longitudinal ligament cells by inhibiting expression of RUNX2 and typeⅠ collagen
WU Shen-shen, XUE Min-tao, SUN Bai-feng, XU Chen, WEI Lei-xin, ZHONG Hua-jian, ZHANG Zi-cheng, LIU Yang, YE Xiao-jian, YUAN Wen     
Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Navy Medical University, Shanghai 200003, China
Abstract: Objective To investigate the function and mechanism of microRNA-218(miRNA-218) in regulating the ossification of posterior longitudinal ligament(OPLL) cells. Methods Posterior longitudinal ligament cells were isolated from both OPLL patients and non-OPLL patients(n=5). The expression levels of miRNA-218 were compared between the 2 groups. Osteogenesis was induced after overexpressing miRNA-218 by agomir or inhibiting miRNA-218 by antagomir, in ligament cells of OPLL patients. The effect of miRNA-218 on the ossification of ligament cells was verified by Alizarin red staining, alkaline phosphatase activity and the expression of osteogenesis-related genes. Target-scan was used to predict the target gene of miRNA-218, and dual-luciferase reporter assay was used to verify the targeting effect of microRNA-218. Results The expression le vel of miRNA-218 was significantly lower in OPLL patients than non-OPLL patients, and the difference was statistically significant(P < 0.05). The overexpression of miRNA-218 resulted in lower level of Alizarin red staining, alkaline phosphatase activities and expression of osteogenesis-related genes, while the inhibition resulted in higher level of Alizarin red staining, alkaline phosphatase activities and expression of osteogenesis-related genes, all with statistical significances(P < 0.05). Targetscan predicted that the target genes of miRNA-218 might be RUNX2 and typeⅠ collagen(COL1A1). Dual-luciferase reporter assay showed that miRNA-218 could reduce the luciferase activity of RUNX2 and COL1A1 genes. Conclusion miRNA218 can significantly inhibit the ossification of primary posterior longitudinal ligament cells, and its mechanism is related to inhibiting the expression of RUNX2 and COL1A1 genes.
Key words: MicroRNAs     Intervertebral disc degeneration     Ossification of posterior longitudinal ligament    

后纵韧带骨化症(OPLL)是由脊柱韧带的异常骨化造成脊髓压迫, 引起患者四肢与躯干感觉、运动及括约肌功能障碍的一类严重危害人类健康的疾病[1-2]。虽然OPLL手术治疗效果确切, 但其具体的发生机制尚不明确。近年研究表明, 微RNA(miRNA)能够通过与mRNA的3′端非翻译区结合, 在OPLL发生过程中起到重要的转录后调控作用[3]。还有研究发现, miRNA-218与成骨分化相关[4], 但其在OPLL中的作用机制尚不清楚。本研究利用原代培养的后纵韧带细胞, 探讨miRNA-218在骨化的后纵韧带细胞中的作用及机制, 以进一步阐明其在OPLL进展中的作用。

1 材料与方法 1.1 后纵韧带细胞的分离培养

取5例OPLL患者及5例非OPLL者的后纵韧带组织, 经清洗、剪碎后进行贴壁培养, 获得原代后纵韧带细胞。后纵韧带细胞培养使用含10%胎牛血清(FBS, Hyclone公司, 美国)、青/链霉素各100 U/mL的DMEM培养液(Gibco公司, 美国), 细胞培养和鉴定方法参见文献[3]。

1.2 RNA抽提与实时荧光定量PCR检测

将处理后的后纵韧带细胞去除培养液, 用RNAiso Plus试剂(TaKaRa公司, 日本)抽提总RNA。miRNA-218检测, 先采用茎环法进行反转录(反转录引物5′-GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGG ATACGACGGCAA-3′), 随后使用上游引物5′-AGTGCGAACTGTGGCGAT-3′和下游引物5′- CGGACTCAAAAGATGGCGGCA-3′进行实时荧光定量PCR反应, 以GAPDH作为内参照基因计算miRNA-218的相对表达量。每组设2个复孔, 实验至少重复3次。

目的基因检测, 将RNA反转录为cDNA, 以cDNA为模板, 用实时荧光定量PCR法检测目的基因的相对表达量。RUNX2上游引物为5′-CTGCCCATCCACTGAGACATA-3′, 下游引物为5′-AGCTTGGGGTCATGGCAAAC-3′; IBSP上游引物为5′-GGCATGAACCTGGCATACAA-3′, 下游引物为5′-TTTCCAGGTAGCCTGAAACCC-3′; Ⅰ型胶原(COL1A1)上游引物为5′-AGTGGTTTGGATGGTGCCAA-3′, 下游引物为5′-GCACCATCATTTCCACGAGC-3′; GAPDH上游引物为5′-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3′, 下游引物为5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。以GAPDH作为内参照基因, 使用StepOneTM(V2.1)软件计算目的基因的相对表达量。每组设2个复孔, 实验至少重复3次。

1.3 miRNA-218表达干预及成骨表型的检测

取OPLL患者第2代后纵韧带细胞, 提前1 d更换培养液以确保细胞生长状态良好。将细胞接种在24孔板内, 分为过表达组、抑制剂组及对照组, 放入恒温培养箱过夜待细胞贴壁。miRNA-218激动剂RNA oligo(miRNA-218 agomir)、miRNA-218抑制剂RNA oligo(miRNA-218 antagomir)、对照RNA oligo(NC agomir/antagomir)由上海吉玛基因合成[5], 终浓度为100 nmol/L, 每孔加入0.5 μL转染试剂稀释液(Promega公司, 美国), 室温孵育10 min, 将转染混合液分别添加到各组细胞中。转染6 h后, 换成骨诱导培养液(Cyagen公司, 美国)诱导培养, 每隔3 d换液。14 d后利用碱性磷酸酶染色试剂盒(上海斯丹赛生物技术有限公司, 中国)对细胞进行染色, 并用酶标仪检测各组细胞340 nm处的光密度(D340)值。21 d后用2%茜素红S染色试剂(ScienCell公司, 美国)对细胞进行染色, 并用酶标仪检测各组细胞550 nm处的光密度(D550)值。用实时荧光定量PCR检测各组成骨相关基因RUNX2IBSP表达量。实验至少重复3次。

1.4 miRNA-218靶基因预测及双荧光素酶报告基因实验

采用Targetscan 6.0(www.targetscan.org)预测miRNA-218靶基因并结合表达谱数据分析[3]确定miRNA-218的潜在靶基因。将报告基因、miRNA-218 RNA oligo、海肾荧光素载体(Renilla)和转染试剂共转染HEK293细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司, 中国)共转染48 h, 之后将细胞进行蛋白裂解处理, 利用带有自动加样器的酶标仪检测裂解蛋白中荧光素酶的活性。实验重复3次。

1.5 统计学处理

应用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用x±s表示, 组间比较根据方差是否齐性采用独立样本t检验或t′检验; 以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 miRNA-218的表达检测

在OPLL患者和非OPLL者后纵韧带细胞传至第2代后, 对其总RNA进行抽提, 并检测miRNA-218表达量, 结果显示OPLL患者韧带细胞miRNA-218水平低于非OPLL者, 差异有统计学意义(0.42±0.12 vs. 1.00±0.13, P < 0.05)。

2.2 miRNA-218过表达对后纵韧带细胞成骨分化的影响

利用agomir使OPLL患者后纵韧带细胞中miRNA-218过表达, 检测成骨诱导分化21 d后韧带细胞成骨分化表型, 结果显示, 茜素红染色水平、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因(RUNX2IBSP)的表达均低于对照组, 差异均有统计学意义(P < 0.05, 图 1)。

a:成骨相关基因表达b:茜素红染色(×100) c:碱性磷酸酶活性(×200) *与对照组比较, P < 0.05 a:Osteogenesis-related gene expression b:Alizarin red staining(×100) c:Alkaline phosphatase activity(×200) * P < 0.05, compared with control group 图 1 miRNA-218过表达对后纵韧带细胞成骨分化的影响 Figure 1 Effect of miRNA-218 overexpression on osteogenic differentiation of posterior longitudinal ligament cells
2.3 抑制miRNA-218表达对后纵韧带细胞成骨分化的影响

利用antagomir抑制OPLL患者后纵韧带细胞中miRNA-218表达, 检测成骨诱导分化21 d后韧带细胞成骨分化表型变化, 结果显示茜素红染色水平、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因(RUNX2IBSP)的表达均高于对照组, 差异均有统计学意义(P < 0.05, 图 2)。

a:成骨相关基因表达b:茜素红染色(×100) c:碱性磷酸酶活性(×200) *与对照组比较, P < 0.05 a:Osteogenesis-related gene expression b:Alizarin red staining(×100) c:Alkaline phosphatase activity(×200) * P < 0.05, compared with control group 图 2 抑制miRNA-218表达对后纵韧带细胞成骨分化的影响 Figure 2 Effect of miRNA-218 inhibition on osteogenic differentiation of posterior longitudinal ligament cells
2.4 miRNA-218靶基因验证分析

采用Target scan预测miRNA-218靶基因并结合表达谱数据分析, 其靶基因可能为RUNX2COL1A1。过表达miRNA-218的OPLL患者后纵韧带细胞RUNX2COL1A1表达水平较对照组降低, 而抑制miRNA-218表达的OPLL患者后纵韧带细胞RUNX2COL1A1表达水平较对照组升高, 差异均有统计学意义(P < 0.05, 图 3a, b)。双荧光素酶报告基因实验显示, miRNA-218过表达能够降低RUNX2COL1A1报告基因的荧光素酶活性(图 3c, d)。

a, b:过表达或抑制表达miRNA-218后RUNX2COL1A1的表达变化c, d:RUNX2COL1A1双荧光素酶报告基因检测*与对照组比较, P < 0.05 a, b:Changes of expression of RUNX2 and COL1A1 after overexpression or inhibition of miRNA-218 c, d:Dual-luciferase reporter assay of RUNX2 and COL1A1 * P < 0.05, compared with control group 图 3 miRNA-218靶基因的预测及验证 Figure 3 Prediction and validation of miRNA-218 target gene
3 讨论

OPLL病因复杂, 且发生机制尚不明确, 一般认为是多种因素共同作用的结果, 具体可分为系统因素与局部因素, 系统因素包括年龄、饮食、糖钙代谢异常、激素功能障碍与基因变异等, 而局部因素包括椎间盘退行性变、椎体不稳等[6]

在OPLL发生过程中, 后纵韧带内含有的间质细胞可对各种生长因子产生反应, 分化为类成骨细胞, 形成钙化, 在新生血管长入后逐渐骨化形成板层骨[7]。骨形态发生蛋白-2(BMP-2)能够诱导韧带细胞分化为类成骨细胞, 而转化生长因子-β(TGF-β)在骨化晚期刺激骨形成[8]。此外, OPLL在非胰岛素依赖型糖尿病、甲状腺功能减退、肥胖症、钙代谢异常患者中发生率较高, 还受到甲状旁腺激素、前列腺素-2、降钙素等骨相关激素的调控[9]

miRNA作为基因表达调控的重要组分, 具有一定的时空特异性。本课题组前期针对OPLL相关致病基因的miRNA进行了细胞组学研究, 发现miRNA-563、miRNA-10a等在OPLL患者中高表达, 并起到重要的调控作用[10]。本研究从OPLL患者中低表达的miRNA-218入手, 进一步挖掘miRNA在OPLL发生、发展过程中的功能及机制。

本研究发现, miRNA-218能够抑制后纵韧带细胞的骨化水平, 减少后纵韧带细胞碱性磷酸酶的活性及钙质的沉积, 其在正常后纵韧带中的高表达可能发挥了其抑制骨化的作用, 具有潜在的药用及靶点价值。本研究还发现, miRNA-218通过影响RUNX2COL1A1的表达抑制骨化, 这与既往研究发现的miRNA-218在多种细胞中能够靶向影响RUNX2骨化作用的结果一致[11]。而COL1A1作为本研究发现的miRNA-218另一个特异性靶基因, 在诱导细胞成骨的过程中亦具有重要作用[12]。本研究结果表明, miRNA-218在影响成骨关键转录因子RUNX2的同时还靶向影响COL1A1, 从减少成骨基质的角度进一步抑制后纵韧带的骨化, 这一发现为进一步揭示OPLL中miRNA调控网络的具体机制提供了实验依据。

尽管本研究已初步明确miRNA-218的下游调控机制, 然而对于导致miRNA-218在OPLL中出现特异性降低的具体原因仍未明确。且相较于研究较为透彻的RNA聚合酶Ⅱ以及下游mRNA的转录启动机制, 对miRNA本身的转录调控机制研究较少[13]。查阅文献发现, miRNA-218主要受到转录后水平的调控, 如lncRNA-HOTAIR能够在转录后水平竞争抑制miRNA-218, 从而使乳腺癌细胞的反射反应性降低[14], 环状RNA-0054633等亦能够通过相同机制影响miRNA-218的表达量[15], 但真正从转录起始水平影响miRNA-218的研究目前还未见报道, 有待后续进一步研究明确。

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