后纵韧带骨化症(OPLL)是由脊柱韧带的异常骨化造成脊髓压迫, 引起患者四肢与躯干感觉、运动及括约肌功能障碍的一类严重危害人类健康的疾病[1-2]。虽然OPLL手术治疗效果确切, 但其具体的发生机制尚不明确。近年研究表明, 微RNA(miRNA)能够通过与mRNA的3′端非翻译区结合, 在OPLL发生过程中起到重要的转录后调控作用[3]。还有研究发现, miRNA-218与成骨分化相关[4], 但其在OPLL中的作用机制尚不清楚。本研究利用原代培养的后纵韧带细胞, 探讨miRNA-218在骨化的后纵韧带细胞中的作用及机制, 以进一步阐明其在OPLL进展中的作用。
1 材料与方法 1.1 后纵韧带细胞的分离培养取5例OPLL患者及5例非OPLL者的后纵韧带组织, 经清洗、剪碎后进行贴壁培养, 获得原代后纵韧带细胞。后纵韧带细胞培养使用含10%胎牛血清(FBS, Hyclone公司, 美国)、青/链霉素各100 U/mL的DMEM培养液(Gibco公司, 美国), 细胞培养和鉴定方法参见文献[3]。
1.2 RNA抽提与实时荧光定量PCR检测将处理后的后纵韧带细胞去除培养液, 用RNAiso Plus试剂(TaKaRa公司, 日本)抽提总RNA。miRNA-218检测, 先采用茎环法进行反转录(反转录引物5′-GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGG ATACGACGGCAA-3′), 随后使用上游引物5′-AGTGCGAACTGTGGCGAT-3′和下游引物5′- CGGACTCAAAAGATGGCGGCA-3′进行实时荧光定量PCR反应, 以GAPDH作为内参照基因计算miRNA-218的相对表达量。每组设2个复孔, 实验至少重复3次。
目的基因检测, 将RNA反转录为cDNA, 以cDNA为模板, 用实时荧光定量PCR法检测目的基因的相对表达量。RUNX2上游引物为5′-CTGCCCATCCACTGAGACATA-3′, 下游引物为5′-AGCTTGGGGTCATGGCAAAC-3′; IBSP上游引物为5′-GGCATGAACCTGGCATACAA-3′, 下游引物为5′-TTTCCAGGTAGCCTGAAACCC-3′; Ⅰ型胶原(COL1A1)上游引物为5′-AGTGGTTTGGATGGTGCCAA-3′, 下游引物为5′-GCACCATCATTTCCACGAGC-3′; GAPDH上游引物为5′-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3′, 下游引物为5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。以GAPDH作为内参照基因, 使用StepOneTM(V2.1)软件计算目的基因的相对表达量。每组设2个复孔, 实验至少重复3次。
1.3 miRNA-218表达干预及成骨表型的检测取OPLL患者第2代后纵韧带细胞, 提前1 d更换培养液以确保细胞生长状态良好。将细胞接种在24孔板内, 分为过表达组、抑制剂组及对照组, 放入恒温培养箱过夜待细胞贴壁。miRNA-218激动剂RNA oligo(miRNA-218 agomir)、miRNA-218抑制剂RNA oligo(miRNA-218 antagomir)、对照RNA oligo(NC agomir/antagomir)由上海吉玛基因合成[5], 终浓度为100 nmol/L, 每孔加入0.5 μL转染试剂稀释液(Promega公司, 美国), 室温孵育10 min, 将转染混合液分别添加到各组细胞中。转染6 h后, 换成骨诱导培养液(Cyagen公司, 美国)诱导培养, 每隔3 d换液。14 d后利用碱性磷酸酶染色试剂盒(上海斯丹赛生物技术有限公司, 中国)对细胞进行染色, 并用酶标仪检测各组细胞340 nm处的光密度(D340)值。21 d后用2%茜素红S染色试剂(ScienCell公司, 美国)对细胞进行染色, 并用酶标仪检测各组细胞550 nm处的光密度(D550)值。用实时荧光定量PCR检测各组成骨相关基因RUNX2和IBSP表达量。实验至少重复3次。
1.4 miRNA-218靶基因预测及双荧光素酶报告基因实验采用Targetscan 6.0(www.targetscan.org)预测miRNA-218靶基因并结合表达谱数据分析[3]确定miRNA-218的潜在靶基因。将报告基因、miRNA-218 RNA oligo、海肾荧光素载体(Renilla)和转染试剂共转染HEK293细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司, 中国)共转染48 h, 之后将细胞进行蛋白裂解处理, 利用带有自动加样器的酶标仪检测裂解蛋白中荧光素酶的活性。实验重复3次。
1.5 统计学处理应用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用x±s表示, 组间比较根据方差是否齐性采用独立样本t检验或t′检验; 以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 miRNA-218的表达检测在OPLL患者和非OPLL者后纵韧带细胞传至第2代后, 对其总RNA进行抽提, 并检测miRNA-218表达量, 结果显示OPLL患者韧带细胞miRNA-218水平低于非OPLL者, 差异有统计学意义(0.42±0.12 vs. 1.00±0.13, P < 0.05)。
2.2 miRNA-218过表达对后纵韧带细胞成骨分化的影响利用agomir使OPLL患者后纵韧带细胞中miRNA-218过表达, 检测成骨诱导分化21 d后韧带细胞成骨分化表型, 结果显示, 茜素红染色水平、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因(RUNX2和IBSP)的表达均低于对照组, 差异均有统计学意义(P < 0.05, 图 1)。
利用antagomir抑制OPLL患者后纵韧带细胞中miRNA-218表达, 检测成骨诱导分化21 d后韧带细胞成骨分化表型变化, 结果显示茜素红染色水平、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因(RUNX2和IBSP)的表达均高于对照组, 差异均有统计学意义(P < 0.05, 图 2)。
采用Target scan预测miRNA-218靶基因并结合表达谱数据分析, 其靶基因可能为RUNX2及COL1A1。过表达miRNA-218的OPLL患者后纵韧带细胞RUNX2及COL1A1表达水平较对照组降低, 而抑制miRNA-218表达的OPLL患者后纵韧带细胞RUNX2及COL1A1表达水平较对照组升高, 差异均有统计学意义(P < 0.05, 图 3a, b)。双荧光素酶报告基因实验显示, miRNA-218过表达能够降低RUNX2和COL1A1报告基因的荧光素酶活性(图 3c, d)。
OPLL病因复杂, 且发生机制尚不明确, 一般认为是多种因素共同作用的结果, 具体可分为系统因素与局部因素, 系统因素包括年龄、饮食、糖钙代谢异常、激素功能障碍与基因变异等, 而局部因素包括椎间盘退行性变、椎体不稳等[6]。
在OPLL发生过程中, 后纵韧带内含有的间质细胞可对各种生长因子产生反应, 分化为类成骨细胞, 形成钙化, 在新生血管长入后逐渐骨化形成板层骨[7]。骨形态发生蛋白-2(BMP-2)能够诱导韧带细胞分化为类成骨细胞, 而转化生长因子-β(TGF-β)在骨化晚期刺激骨形成[8]。此外, OPLL在非胰岛素依赖型糖尿病、甲状腺功能减退、肥胖症、钙代谢异常患者中发生率较高, 还受到甲状旁腺激素、前列腺素-2、降钙素等骨相关激素的调控[9]。
miRNA作为基因表达调控的重要组分, 具有一定的时空特异性。本课题组前期针对OPLL相关致病基因的miRNA进行了细胞组学研究, 发现miRNA-563、miRNA-10a等在OPLL患者中高表达, 并起到重要的调控作用[10]。本研究从OPLL患者中低表达的miRNA-218入手, 进一步挖掘miRNA在OPLL发生、发展过程中的功能及机制。
本研究发现, miRNA-218能够抑制后纵韧带细胞的骨化水平, 减少后纵韧带细胞碱性磷酸酶的活性及钙质的沉积, 其在正常后纵韧带中的高表达可能发挥了其抑制骨化的作用, 具有潜在的药用及靶点价值。本研究还发现, miRNA-218通过影响RUNX2与COL1A1的表达抑制骨化, 这与既往研究发现的miRNA-218在多种细胞中能够靶向影响RUNX2骨化作用的结果一致[11]。而COL1A1作为本研究发现的miRNA-218另一个特异性靶基因, 在诱导细胞成骨的过程中亦具有重要作用[12]。本研究结果表明, miRNA-218在影响成骨关键转录因子RUNX2的同时还靶向影响COL1A1, 从减少成骨基质的角度进一步抑制后纵韧带的骨化, 这一发现为进一步揭示OPLL中miRNA调控网络的具体机制提供了实验依据。
尽管本研究已初步明确miRNA-218的下游调控机制, 然而对于导致miRNA-218在OPLL中出现特异性降低的具体原因仍未明确。且相较于研究较为透彻的RNA聚合酶Ⅱ以及下游mRNA的转录启动机制, 对miRNA本身的转录调控机制研究较少[13]。查阅文献发现, miRNA-218主要受到转录后水平的调控, 如lncRNA-HOTAIR能够在转录后水平竞争抑制miRNA-218, 从而使乳腺癌细胞的反射反应性降低[14], 环状RNA-0054633等亦能够通过相同机制影响miRNA-218的表达量[15], 但真正从转录起始水平影响miRNA-218的研究目前还未见报道, 有待后续进一步研究明确。
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