2022, Vol.20 
Issue(4): 263-267
2. 首都医科大学附属北京天坛医院骨科, 北京 100050
2. Department of Orthopaedics, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China
后纵韧带骨化症（OPLL）的特征是异位骨形成替代韧带组织[1-2]。OPLL在亚洲人中的发生率高于欧洲人和美国人，有报道[3]显示，OPLL在日本的发生率为1.9% ~ 4.3%，在中国为0.44% ~ 8.92%。目前OPLL的发生机制仍未完全阐明，遗传因素和环境因素在其发生过程中均起作用。既往研究[4-9]表明，遗传因素是OPLL的主要因素，并且和环境因素相互作用。骨形态发生蛋白（BMP）是转化生长因子-β（TGF-β）超家族的成员，BMP结合骨形态发生蛋白受体-ⅠA（BMPR-ⅠA）、BMPR-ⅠB和BMPR-Ⅱ，通过Smad信号转导通路刺激成骨细胞分化[10-11]。BMPR-ⅠA是BMPR家族的一种亚型，在BMP信号转导通路中起着重要调节作用[12-14]。既往研究[10]表明，BMPR-ⅠA在异位骨化的发生、发展中起着重要作用。本研究旨在探讨BMPR-ⅠA在OPLL发展中的作用，评估其是否为OPLL的易感基因，现报告如下。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器DNA纯化试剂盒（Promega公司，美国）；C3H10T1/2细胞（北京协和细胞库，中国）；引物和pcDNA3.1-BMPR-ⅠA质粒（Invitrogen公司，美国）；ABI 3730XL POP7 DNA测序分析5.2系统（Applied Biosystems公司，美国）；Lipofectamine 2000转染试剂盒、胎牛血清和培养基（Invitrogen公司，美国）；BMPR-ⅠA特异性单克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）；P-Smad1/5/8和Smad4多克隆抗体（CST公司，美国）；碱性磷酸酶（AKP/ALP）测试盒和骨钙素（OST）测试盒（南京建成生物工程研究所，
中国）。
1.2 材料获取选择首都医科大学附属北京地坛医院和天坛医院收治的292例OPLL患者和586名非OPLL者（表 1）。OPLL的诊断主要基于影像学检查，包括X线、CT和MRI。OPLL分型由侧位X线片和CT确定。根据影像学和实验室检查，排除强直性脊柱炎和其他代谢性疾病（如骨软化症、骨质疏松症、弥散性特发性骨骼肥大症或甲状旁腺功能亢进症）。本研究经医院伦理委员会审核批准（KY2011-005-01），所有参与者知情同意并签署知情同意书。
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表 1 2组患者一般资料 |
使用DNA纯化试剂盒分离DNA，通过PCR扩增整个BMPR-ⅠA编码序列，通过ABI 3730XL POP7 DNA测序分析5.2系统对PCR产物进行基因分型，相关引物见表 2，排除杂合度未知且等位基因频率低于5%的SNP位点。
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表 2 BMPR-ⅠA引物序列 |
取第10代C3H10T1/2细胞，按照1.5×104/孔的密度接种于6孔板内，待细胞生长至60% ~ 80%汇合时，使用Lipofectamine 2000通过pcDNA3.1-BMP2质粒进行转染。随机将细胞分为6组：正常组、空载体组、野生型组、rs34755052单突变组、rs11528010单突变组和双突变组。
1.5 蛋白质印迹法检测各组BMPR-ⅠA、P-Smad1/5/8和Smad4的表达用PBS缓冲液清洗3次，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，匀浆器匀浆、4℃下12 000×g离心10 min（g=9.806 65 m/s2），取上清测定蛋白浓度，取等量蛋白提取物通过SDS-PAGE进行分离，电泳转移到硝酸纤维素膜上。将膜在5%脱脂牛奶的1×Tris缓冲盐水和1×TBST中封闭1 h，然后与特异性单克隆抗体在室温下孵育4 h，与二抗在室温下孵育1 h，通过化学发光进行显色，使用Kodak Image Station扫描并分析。
1.6 检测ALP和OC活性将细胞转入50 mmol Tris（pH 7.40）中，并通过超声裂解。采用酶联免疫吸附法，37℃时以10 mmol对硝基苯基磷酸酯为底物的测定缓冲液（100 mmol Sigma221缓冲液含10 mmol MgCl2，pH 10.3）中测试细胞裂解物的ALP和OC活性。使用OD405的光密度读取反应混合物，并使用对硝基苯酚的标准曲线（P-NP 500 nmol/ml，Sigma）作为参考。
1.7统计学处理
采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以x±s表示，Hardy-Weinberg平衡以及基因型和等位基因分布采用χ2检验，组间比较采用独立样本t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 2组BMPR-ⅠA的SNP位点基因型和等位基因分布共鉴定12个既往报道过的BMPR-ⅠA的SNP位点，其中，rs34755052（C/T）和rs11528010（C/A）的频率组间差异有统计学意义（P < 0.05，表 3）。2个位点的基因型和等位基因分布比较，rs34755052（C/T）中“CC”“CT”和“TT”基因型差异有统计学意义（P < 0.05，表 3），且OPLL组中“C”“T”等位基因的频率低于非OPLL组，差异有统计学意义（P < 0.05，表 3）。rs11528010（C/A）中的“CC”“CA”和“AA”基因型差异有统计学意义（P < 0.05，表 3），且OPLL组中“C”“A”等位基因的频率低于非OPLL组，差异有统计学意义（P < 0.05，表 3）。
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表 3 2组rs34755052（C/T）和rs11528010（C/A）的基因型和等位基因分布 |
蛋白质印迹法检测结果显示，野生型组、rs34755052单突变组、rs11528010单突变组、双突变组的BMPR-ⅠA蛋白表达明显高于正常组和空载体组，且各突变组均高于野生型组，差异具有统计学意义（P < 0.05，图 1）。
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图 1 各转染组细胞BMPR-ⅠA蛋白表达 注：*与正常组和空载体组比较，P < 0.05；△与野生型组比较，P < 0.05。 |
蛋白质印迹法检测结果显示，野生型组、rs34755052单突变组，rs11528010单突变组、双突变组的P-Smad1/5/8蛋白表达明显高于正常组和空载体组，差异具有统计学意义（P < 0.05，图 2）；且rs34755052单突变组和双突变组明显高于rs11528010单突变组和野生型组，差异具有统计学意义（P < 0.05，图 2）。各组P-Smad4蛋白表达差异无统计学意义（P > 0.05，图 3）。
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图 2 各转染组细胞P-Smad1/5/8蛋白表达 注：*与正常组和空载体组比较，P < 0.05；△与rs11528010单突变组和野生型组比较，P < 0.05。 |
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图 3 各转染组细胞P-Smad4蛋白表达 |
野生型组、rs34755052单突变组、rs11528010单突变组和双突变组的ALP活性明显高于正常组和空载体组，rs34755052单突变组高于其他突变组和野生型组，野生型组高于rs11528010单突变组，差异均有统计学意义（P < 0.05，表 4）。
野生型组和rs34755052单突变组的OC活性明显高于正常组和空载体组，差异有统计学意义（P < 0.05，表 4）。
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表 4 各转染组细胞ALP和OC活性 |
BMPR-ⅠA可能在OPLL发展的不同阶段发挥重要作用。首先，病理学研究[15]发现，BMPR在OPLL患者的骨化韧带组织中高表达；其次，免疫组织化学研究[16]表明，骨化基质中存在BMPR-ⅠA；此外，还有研究[17-18]表明，微调水平的BMPR-ⅠA介导的信号对于牙齿和颞下颌关节的发育至关重要。
本研究首先分析了BMPR-ⅠA整个编码区内的遗传变异是否与OPLL发生有关，共鉴定了12个SNP位点，发现OPLL患者和非OPLL者的rs34755052（C/T）和rs11528010（C/A）位点频率不同。比较OPLL患者和非OPLL者2个SNP位点的基因型和等位基因的分布发现，rs34755052（C/T）中“CC”“CT”“TT”基因型有差异，rs11528010（C/A）中的“CC”“CA”“AA”基因型有差异，表明“CT”基因型和“CA”基因型与OPLL的发生有关。但是，鉴于rs34755052（C/T）位于BMPR-ⅠA基因的上游，而rs11528010（C/A）位于BMPR-ⅠA基因的第3外显子，该SNP位点对OPLL遗传易感性的影响尚不确定。既往研究[19]发现，BMPR-ⅠA基因上游有部分转录因子结合位点影响了BMPR-ⅠA的表达，并导致原本具有不良成骨活性的细胞发生钙化。因此，本研究组进一步检测这些SNP位点是否影响BMPR-ⅠA的基因表达和细胞内信号转导。BMP信号通路主要通过Smad介导的信号转导途径发生，在BMP信号通路中，P-Smad1/5/8和Smad4是关键蛋白，而ALP和OC是成骨细胞特异性蛋白[13, 20-22]。本研究发现，野生型组和各突变组表达的BMPR-ⅠA蛋白明显高于正常组和空载体组，而各突变组又高于野生型组，表明野生型或突变型载体可以成功转染到C3H10T 1/2细胞中并且可以稳定表达。野生型组和各突变型组表达的P-Smad1/5/8蛋白明显高于正常组和空载体组，其中rs34755052单突变组又高于其他突变组和野生型组，表明BMPR-ⅠA基因的rs34755052（C/T）位点与P-Smad1/5/8蛋白表达呈正相关。野生型组和各突变组ALP活性明显高于正常组和空载体组，其中rs34755052单突变组又高于其他突变组和野生型组，野生型组又高于rs11528010单突变组，表明BMPR-ⅠA基因的rs34755052（C/T）位点与ALP活性呈正相关。野生型组和rs34755052单突变组OC活性明显高于正常组和空载体组，表明BMPR-ⅠA基因的rs34755052（C/T）位点与OC活性呈正相关。综上，rs34755052（C/T）位点通过影响BMPR-ⅠA空间构象的核苷酸变化进而导致蛋白质功能异常。
早期的OPLL可采用非手术治疗，但大多数OPLL患者病情是进展性的，因此，常须手术治疗。近年来问世的新靶点药物或许能够为其提供新的治疗选择。Smad介导的信号通路在BMPR-ⅠA基因的SNP位点诱导OPLL的病理过程中起着重要作用，因此成为OPLL治疗的靶点之一，在以后的研究中，该领域还需要更进一步研究。有研究[23]发现，自然状态下骨化灶轴向长度每年增长约2.0 mm，厚度每年增长约0.2 mm，连续型和/或混合型骨化灶为骨化进展的主要危险因素。与自然进程相比，后路椎板切除融合术、各种前路手术均能减缓OPLL进展，而无内固定的椎板切除术、椎板成形术则会加快骨化进展。本研究中连续型和混合型OPLL患者约占53.4%，须引起重视。但是，该差异是否有其相应的遗传分子机制，尚须进一步研究。
本研究的局限性。首先，尽管C3H10T1/2细胞已被用作人类胚胎成纤维细胞的替代模型用来研究成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的分子机制，但仍会出现不完全相同的表型导致偏差。其次，本研究组没有检测其他成骨基因的表达，例如Runt相关转录因子2（RUNX2）、Ⅰ型胶原蛋白alpha1（COL1A1）和骨桥蛋白（OPN），因此，无法了解其他易感基因及其致病性。此外，尽管BMPR-ⅠA基因中2个SNP位点与OPLL的发生有关，但其发生的详细机制仍然不完全清楚，在后续研究中，需要进一步研究明确BMPR-ⅠA的特定功能。
综上，BMPR-ⅠA是OPLL的易感基因之一。rs34755052（C/T）中的“CT”基因型和rs11528010（C/A）中的“CA”基因型与OPLL的发生有关。BMPR-ⅠA基因上游的rs34755052（C/T）位点与P-Smad1/5/8蛋白表达水平及ALP和OC活性呈正相关。Smad介导的信号通路在BMPR-ⅠA诱导OPLL的病理过程中起着重要作用。
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