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Issue(2): 123-128
2. 中国人民解放军海军第905医院骨科，上海 200052
2. Deparment of Orthopaedics, No.905 Hospital of PLA Navy, Shanghai 200052, China
颈椎后纵韧带骨化症（OPLL）是附着于椎体后缘的后纵韧带在多因素作用下发生异常增厚和骨化的现象，是常见的颈椎退行性疾病之一，可导致严重的感觉和运动功能障碍[1]。目前，OPLL的发生机制尚不清楚，其早期诊断和治疗方式仍然有限。有文献[1]报道，遗传与环境因素共同参与了OPLL的发生。目前已知有多个基因（COL6A1、COL6A6、TLR1、FGFRI、BMP2、Runx2等）与OPLL的发生、发展有关[2-4]，涉及的相关信号通路，包括转化生长因子β/骨形态发生蛋白（TGF-β/BMP）、cAMP/PKA、MAPK、Wnt、JAK/STAT、Pi3k/Akt等[5-10]。除遗传相关因素外，机械应力也能够加速OPLL的发展，循环拉伸应力可以通过Notch和Wnt信号通路促进后纵韧带细胞的成骨分化[11-12]，大量的微RNA（miRNA）通过这些信号通路参与了OPLL的形成[13]，并在其中起着至关重要的作用。另外，生物标志物的改变与OPLL也有密切的联系，除了已经报道过的血清胰岛素、瘦素和骨钙素外，Kawaguchi等[14]还报道了血清FGF-23和骨膜蛋白在OPLL患者中升高。此外，生活方式同样与OPLL的发生相关，Chaput等[15]的研究结果显示，年龄大、体质量指数（BMI）高和高血压是OPLL的危险因素。本文通过查阅miRNA与OPLL的相关研究，综述了miRNA通过靶向影响成骨信号通路的特定因子在OPLL中的作用及miRNA作为特异性诊断标志物和潜在治疗靶点的临床价值。
1 miRNA在OPLL发生、发展中的作用 1.1 调节细胞成骨分化Yayama等[16]对后纵韧带行组织学检查，结果显示，正常韧带组织主要由成束的弹性纤维和胶原纤维组成，排列规则；脊髓型颈椎病患者的韧带则表现出不规则的纤维束分布形态，包括弹性纤维断裂。弹性纤维和胶原纤维中的间充质干细胞和软骨细胞数量非常少；而骨化后纵韧带的纤维束排列的不规则性更加明显，包括纤维基质扩张和间充质干细胞、成纤维样细胞的积聚以及血管形成。骨化后纵韧带组织中存在多种细胞，如间充质干细胞、成纤维细胞、成骨细胞、成软骨细胞及少部分的炎性细胞等。与骨化病变相邻的骨化前沿区域包含不同分化阶段的软骨细胞，这些细胞受多种生长因子和转录因子的调节[16]，尽管这些细胞被认为来源于成纤维样细胞或韧带基质中的间充质细胞，但成骨细胞分化机制的细节仍不确定。有文献[17-18]报道，对骨化后纵韧带的细胞进行原代培养后所获得的细胞主要成分为成纤维样细胞，因此，这些成纤维样细胞被认为是促进OPLL发生、发展最主要的细胞，称为OPLL细胞。有研究[6]表明，与正常韧带细胞相比，OPLL细胞更容易被诱导成骨分化，且OPLL细胞的矿化能力明显高于正常韧带细胞。后纵韧带细胞的成骨分化是一个复杂的过程，涉及多种转录因子及信号通路，包括Runx2、TGF-β/BMP、cAMP/PKA、MAPK、Wnt、JAK/STAT、Pi3k/Akt[5-10]。
1.1.1 Runx2信号通路Runx2在诱导成骨细胞分化中起关键作用，并直接调控其他转录因子[19]。Xu等[20]的研究表明，miR-10a-3p通过靶向调控ID3/Runx2通路促进后纵韧带细胞成骨分化。由于ID3是Runx2的抑制剂，miR-10a-3p靶向负调控ID3，增加Runx2的表达，促进OPLL的发生、发展。Zhang等[21]通过测序共发现11个Runx2靶向miRNA，这些miRNA在成骨分化过程中并不同时上调，miR-218在分化早期上调，其他miRNA在分化后期上调，在分化后期Runx2水平显著降低，提示除miR-218外，其余miRNA均通过靶向作用Runx2负向调控成骨分化。此外，结果的多样性也提示不同miRNA之间存在协同或拮抗作用。miRNA还可以间接靶向作用Runx2调控成骨。Yu等[22]的研究发现，miR-690可抑制编码核因子κB（NF-κB）亚基p65的mRNA的翻译，p65低表达可促进Runx2诱导的细胞成骨分化。Godfrey等[23]的研究发现，miR-23a~27a~24-2簇通过靶向抑制Runx2和SATB2的协同作用抑制成骨。尽管上述研究仅局限于细胞的成骨分化层面，但根据Xu等[24]的研究结果，在OPLL细胞中确实检测到了上述miRNA的表达变化，因此，笔者认为，大量的miRNA通过Runx2调控后纵韧带细胞的成骨分化。
1.1.2 TGF-β/BMP信号通路BMP与相应受体结合并招募Smad蛋白参与基因调控[25]。然而，Smad蛋白家族如何影响成骨细胞仍然存在争议[26-27]。有研究[28]表明，BMP受体-IA基因的多态性与OPLL的发生显著相关，Smad相关信号通路在OPLL发生过程中可能发挥重要作用。在成骨分化期间，Smad1/5/8在OPLL患者的间充质干细胞中被异常激活[29]。另外，Mukhametov等[30]报道，miR-141和miR-200a可靶向作用于DLX5通过BMP2途径诱导前成骨细胞分化。Liu等[31]报道了miR-106b可直接靶向抑制BMP2，抑制成骨分化和骨形成。
有研究[32]对OPLL相关的候选基因进行全基因组微阵列分析发现，BMP4 mRNA基因和特定单倍型TGGGCTT的新突变增加了OPLL发生的风险，并影响OPLL的严重程度。Lim等[33]报道，miR-146a、miR-149、miR196a2和miR-499的多态性与OPLL相关，其基因型差异与OPLL的发生风险相关。另一方面，与非OPLL细胞相比，OPLL细胞似乎表现出不同的表型。Ning等[34]通过培养后纵韧带细胞发现，成骨基因在骨化组的表达水平高于非骨化组。Ikuta等[35]通过转录组分析发现，受到拉伸刺激的OPLL细胞释放多种介导骨重塑的因子，而非OPLL细胞则无阳性表达，表明OPLL细胞对机械应力敏感度高。Jiang等[7]检测到miR-497-5p和miR-195-5p在OPLL患者的后纵韧带组织中表达下调；进一步研究发现，机械刺激可诱导其下调。因此，笔者推测正常后纵韧带细胞在频繁的机械应力刺激等因素作用下，可能会发生一定程度的基因表达变化，影响细胞中miRNA的表达，导致成骨分化的发生和OPLL的形成。
1.1.3 Wnt信号通路Wnt/β-Catenin信号通路对人体骨量的调节至关重要[36]。Wnt信号通路促进间充质干细胞在早期分化过程中的增殖，并促进其分化为成骨细胞系。β-Catenin是Wnt信号通路的关键蛋白，是骨形成所必需的，并在成骨细胞分化的多个阶段起作用[37]。Wnt信号通路可与BMP、TGF-β、FGF、Notch等其他信号通路发生串联作用，这种跨功能相互作用形成了骨的基因调控网络[38]。Fushimi等[39]的研究发现，miR-140-3p作为Wnt3a和TGF-β3信号通路之间的关键调节因子参与成骨细胞分化。Yayama等[16]通过miRNA阵列分析，在OPLL和脊髓型颈椎病患者的培养细胞中共检测到177个差异表达的miRNA，其中包括12个显著下调；进一步分析发现，miR-487b-3p可靶向作用14个不同的基因，其中大多数与Wnt信号通路相关，相关目标功能包括血管生成、调控软骨细胞分化、增强成骨相关因子转录活性等。Xu等[40]通过高通量测序分析比较了OPLL组和非OPLL组的miRNA差异，发现miR-520d-3p、miR-4782-3p和miR-6766-3p可刺激LEF1过表达，通过Wnt信号通路导致OPLL；另一方面，SP1也可以上调miR-199b-5p，使Wnt2失活，导致OPLL；这2种机制可能通过单独或协同作用导致OPLL。Sp7（Osterix）是一种锌指转录因子，Shi等[41]发现Sp7在OPLL组织中上调，Sp7的沉默抑制了OPLL细胞的骨化和Wnt信号通路的激活；进一步研究发现，Sp7通过直接激活Dickkopf-1（Dkk1）负调节Wnt信号通路。还有文献[42]报道，miR-98可通过靶向作用FIAT促进成骨细胞矿化，Sp7通过结合miR-98的启动子直接促进其表达，miR-98可能是促进OPLL发生的潜在miRNA之一。
1.1.4 其他信号通路Xu等[18]报道了OPLL中小细胞外囊泡介导的miR-320e靶向作用TAK1促进OPLL，且可能与MAPK信号通路有关。Liu等[43]的研究发现，miR-181a-5p过表达可靶向抑制PBX1表达，进而调节成骨相关基因启动子中组蛋白甲基化和乙酰化水平，促进OPLL。张浩等[44]发现，miR-563能够明显促进OPLL患者后纵韧带原代细胞的成骨分化，其作用与靶向抑制SMURF1相关。Jiang等[7]报道了miR-195和miR-497的过表达可通过下调ADORA2A使cAMP/PKA信号通路失活，从而降低后纵韧带细胞中成骨因子的表达，且在OPLL患者的后纵韧带组织中发现了miR-195和miR-497的下调。
但在不同的研究中报告了少数miRNA似乎具有不同的表达趋势。Zhang等[21]和Shi等[45]在MC3T3-E1细胞和小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中发现miR-218上调；而Xu等[46]的结果显示，与非OPLL组相比，miR-218-3p在OPLL组中表达明显降低。笔者推测可能是不同的细胞或前体miRNA加工的差异。此外，Xu等[24]通过转录组分析发现miR-520d-3p在OPLL中上调；而Xu等[40]通过基因组富集分析发现SP1转录因子下调miR-520d-3p，刺激LEF1过表达，并通过Wnt信号通路导致OPLL，miR-520d-3p在OPLL中应该是下调的。因此，miRNA在OPLL中的表达还有待进一步研究。
1.2 与其他非编码RNA相互作用miRNA还可与其他非编码RNA相互作用，如长链非编码RNA（lncRNA）、短链干扰RNA（siRNA）和环状RNA（circRNA）。这些非编码RNA大多位于上游，作为分子海绵与miRNA结合参与调控。Liao等[47]发现，lncRNA XIST可通过miR-17-5P/AHNAK/BMP2通路调控OPLL；生物信息学分析显示，lncRNA XIST具有miR-17-5p的4个结合位点；在颈椎OPLL患者的后纵韧带成纤维细胞中lncRNA XIST高表达，miR-17-5p表达降低。进一步研究表明，miR-17-5p可通过靶向作用AHNAK抑制BMP2信号通路的激活。因此，lncRNA XIST的上调可能促进OPLL的发展。有趣的是，体外实验发现机械应力可以上调lncRNA XIST，这为机械应力可诱导OPLL提供了实验证据，并论证了可能的途径。据报道，miR-1具有抗成骨功能，Yuan等[48]发现lncRNA MALAT1可作为miR-1海绵促进OPLL，OPLL组织中lncRNA MALAT1水平显著升高。通过激活miR-1或直接阻断下游效应物，可以抑制这种增强，这可能是治疗OPLL的一种方法。Wang等[49]报道，lncRNA SNHG1可通过分离miR-320b和激活JAK/STAT信号通路上调IFNGR1，促进OPLL。Jiang等[50]对circRNA-miRNA-mRNA测序进行了全面分析，结果显示，146种circRNA在OPLL组织中存在差异表达，其中circ-0007292被认为是miR-508-3p的海绵，可抑制miR-508-3p在OPLL细胞中对SATB2的负调控进而促进OPLL[51]。
2 OPLL的特异诊断标志物和潜在治疗靶点OPLL发生隐匿，特异性不高，尽管目前的影像学检查已经可以明确诊断OPLL，但患者就诊时已经受到严重的脊髓压迫，错过最佳手术时机。颈椎CT能够清晰显示后纵韧带的异位骨化，是诊断OPLL的最佳方法，但CT为非常规体检项目，无法进行有效的早期筛查。OPLL的早期诊断和药物缓解治疗非常重要，如果能够通过血清标志物或其他常规检查方式早期诊断或找到相关高危风险因素，早期进行干预，能够大大提升预后。此外，对于OPLL的治疗，目前的临床治疗药物只能缓解疼痛和滋养神经，而不能起到根治作用；手术切除是解除脊髓压迫最直接有效的方式，但术后相关并发症及因神经刺激引起的术前症状进一步加重等也不容忽视。因此，亟需探索新的治疗方法。
Xu等[24]对OPLL细胞进行培养，发现与正常后纵韧带原代细胞相比，OPLL原代细胞中的miRNA有差异表达，其中144个上调，74个下调；进一步筛选出10个与OPLL相关的miRNA，其中miR-10a-3p在OPLL组中显著升高，但在OPLL组和椎间盘退行性变组无区别；在OPLL组中，miR-218-1-3p表达与椎间盘退行性变组有显著差异，与正常组无差异。Xu等[46]的研究发现，在诊断OPLL方面，miR-10a-5p、miR-563、miR-210-3p的组合显示出比单个miRNA更好的诊断价值，与非OPLL组相比，miR-10a-5p、miR-563呈显著上调趋势，miR-210-3p呈显著下调趋势；此外，在OPLL患者中，miR-210-3p在血液和组织样本中的表达是相反的，因此，miRNA在OPLL中的表达情况尚需更多的统计分析。
miRNA也可作为疾病的治疗靶点。最近有研究[52]报道，在癌症、心脏病、肝炎等动物模型实验中使用替代miRNA或miRNA抑制剂治疗，均取得了良好的疗效。目前已有大量研究证实miRNA在OPLL中的调控作用，一些学者认为使用相关的miRNA模拟物或anti-miR延缓，甚至阻断骨化的进展是合理的，这为OPLL的治疗提供了新的思路[40]。此外，针对miRNA上游靶点的治疗，如lncRNA和circRNA，似乎也是一种可行的选择，但尚需实验证据进一步验证。
3 结语与展望近年来，miRNA在OPLL发展中的调控机制研究取得了很大进展，对miRNA的深度挖掘为OPLL的预测和治疗提供了良好的基础。OPLL的发生、发展涉及多种成骨相关信号通路，多种基因及转录因子参与这一过程，miRNA通过调控这些基因或转录因子的表达影响相关的信号通路，促进或抑制骨化的形成和发展。此外，OPLL细胞具有独特的表型，与正常韧带细胞相比，差异表达部分miRNA。因此，笔者假设OPLL细胞可能发生一定程度的体细胞突变，并通过改变miRNA表达形成具有成骨分化倾向的表型。这种体细胞突变可能与潜在的基因改变相关，也可能由外界刺激（如局部机械应力的反复作用）作为启动因素，进而形成更易耐受应力作用的骨化物。总之，miRNA在OPLL中的差异表达未来或许可作为OPLL的特异性诊断标志物和潜在的治疗靶点，但目前还没有对miRNA进行完整系统的讨论，很多问题没有得到解决，miRNA对OPLL影响的研究还局限于细胞和动物实验。特异性诊断标志物及miRNA抑制剂治疗OPLL能否应用于临床还有待进一步研究。
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