脊柱外科杂志  2024, Vol.22 Issue(3): 158-163   PDF    
Ⅰ型骨质疏松症患者长链非编码RNA WT1-AS与骨密度关系
冉仁国1, 张岱阳1, 李贺伟2     
1. 恩施土家族苗族自治州中心医院脊柱外科,恩施 445000;
2. 华中科技大学同济医学院附属梨园医院骨科,武汉 430077
摘要: 目的 探讨Ⅰ型骨质疏松症(OP)患者血清长链非编码RNA(lncRNA)WT1-AS水平与骨密度(BMD)及骨代谢指标的相关性。方法 纳入2018年9月—2020年9月恩施土家族苗族自治州中心医院收治的女性Ⅰ型OP患者108例(OP组),同期绝经后骨量减少者114例(骨量减少组)以及同期年龄相符的绝经后非OP女性120例(对照组)。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定研究对象血清lncRNA WT1-AS水平,采用酶联免疫法测定骨代谢指标,包括血清骨钙素(OCN)、β-胶原降解产物(β-CTX)和Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)。采用Pearson法分析OP患者血清lncRNA WT1-AS与BMD及骨代谢指标相关性,采用logistic回归法分析影响OP发生的因素;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清lncRNA WT1-AS对OP的诊断价值。沉默大鼠前成骨细胞的lncRNA WT1-AS表达,观察lncRNA WT1-AS对前成骨细胞分化和矿化的作用。结果 与对照组和骨量减少组相比,OP组OCN水平降低,β-CTX、PINP水平和lncRNA WT1-AS相对表达量升高,差异均有统计学意义(P < 0.05)。OP患者血清lncRNA WT1-AS水平与BMD(L1~4和股骨颈)、OCN水平呈负相关(r=-0.542、-0.557、-0.608),与β-CTX、PINP水平呈正相关(r=0.576、0.595)。血清lncRNA WT1-AS水平是影响OP发生的危险因素。血清lncRNA WT1-AS水平诊断OP的ROC曲线下面积(AUC)为0.796,特异度为92.11%,灵敏度为62.96%。沉默大鼠前成骨细胞的lncRNA WT1-AS表达,可促进矿化结节生成。结论 Ⅰ型OP患者血清lncRNA WT1-AS异常高表达与BMD、骨代谢有关,且影响Ⅰ型OP的发生,对OP具有一定的诊断价值。
关键词: 骨质疏松    RNA,长链非编码    WT1蛋白质    
Relationship between long noncoding RNA WT1-AS and bone mineral density in patients with typeⅠosteoporosis
Ran Renguo1, Zhang Daiyang1, Li Hewei2     
1. Department of Spinal Surgery, Central Hospital of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture, Enshi 445000, Hubei, China;
2. Department of Orthopaedics, Liyuan Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430077, Hubei, China
Abstract: Objective To investigate the correlation of serum long noncoding RNA(lncRNA) WT1-AS level with bone mineral density(BMD) and bone metabolism indexes in patients with typeⅠosteoporosis(OP). Methods From September 2018 to September 2020, 108 female patients with typeⅠOP(OP group), 114 women with postmenopausal osteopenia(osteopenia group), and 120 postmenopausal women without OP(control group) treated in Central Hospital of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture were admitted. Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR) was used to measure the serum lncRNA WT1-AS levels, and enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure bone metabolism indicators, including serum osteocalcin(OCN), β-collagen degradation product(β-CTX), and typeⅠprocollagen N-terminal propeptide(PINP). Pearson's method was used to analyze the correlation between serum lncRNA WT1-AS and BMD in OP patients, and logistic regression was used to analyze the factors affecting the occurrence of OP. The diagnostic value of serum lncRNA WT1-AS for OP was analyzed using receiver operating characteristic(ROC) curve. The expression of lncRNA WT1-AS in rat osteoblasts was silenced, and the effect of lncRNA WT1-AS on the differentiation and mineralization of osteoblasts was observed. Results Compared with the control group and osteopenia groups, OP group had lower OCN level, and higher serum β-CTX, PINP levels and relative expression of lncRNA WT1-AS, and the differences were statistically significant(P < 0.05). The serum lncRNA WT1-AS level in OP patients was negatively correlated with BMD(L1-4 and femoral neck) and OCN(r=-0.542, -0.557, -0.608), and positively correlated with β-CTX and PINP levels(r=0.576, 0.595). The serum lncRNA WT1-AS level was the risk factor affecting the occurrence of OP. The area under the ROC curve(AUC) of serum lncRNA WT1-AS level for diagnosing OP was 0.796, with the specificity of 92.11% and sensitivity of 62.96%. The silencing of lncRNA WT1-AS expression in rat osteoblasts promoted the formation of mineralized nodules. Conclusion The abnormally high expression of serum lncRNA WT1-AS in typeⅠOP patients is related to BMD and bone metabolism, and affects the occurrence of typeⅠOP, which has a certain diagnostic value for OP.
Key words: Osteoporosis    RNA, long noncoding    WT1 proteins    

骨质疏松症(OP)是多因素导致的骨微结构破损、骨密度(BMD)降低、骨脆性增加的全身性骨病[1]。Ⅰ型OP患者具有疼痛加重、行动受限、脊柱变形、易骨折等症状,给患者、家庭、社会造成沉重的负担[2]。临床中BMD检测是反映骨头状态的有效方式[3]。骨代谢指标可反映骨吸收与骨形成的关系,与BMD存在密切联系[4],骨钙素(OCN)、β-胶原降解产物(β-CTX)、Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)是常用的骨代谢指标。分子生物学为OP的机制研究及疾病预测提供了新的方式,寻求方式简单、结果高效的血清学指标是研究的热点。多项研究[5-6]显示,长链非编码RNA(lncRNA)可通过调控成骨分化相关信号通路参与OP的进展。lncRNA WT1-AS是一种功能性lncRNA,其可参与对PI3K、p53通路的调控[7-8],而PI3K、p53等通路在OP的骨代谢中发挥作用[9-10]。Wang等[11]的研究显示,lncRNA WT1-AS在OP患者中上调,且与p53表达呈正相关,与p53相互作用调节成骨细胞的凋亡。lncRNA WT1-AS在OP患者中表达水平发生变化,但其在Ⅰ型OP患者中与骨代谢及BMD的相关性证据仍欠缺。本研究分析了绝经期女性OP患者血清lncRNA WT1-AS水平与BMD和骨代谢的关系,为血清lncRNA WT1-AS在OP发展中的作用提供证据。

1 资料与方法 1.1 一般资料

纳入2018年9月—2020年9月恩施土家族苗族自治州中心医院收治的女性Ⅰ型OP患者108例(OP组),纳入标准:①闭经1年及以上[12];②股骨颈或腰椎BMD T值< -2.5;③1个月内未服用钙剂、维生素D、激素类药物;④患者心、肝、脾、肺等多脏器无功能异常。排除标准:①合并恶性肿瘤;②近3个月内发生骨折;③合并甲状旁腺疾病、肾上腺疾病等可能影响骨代谢的疾病;④合并神经系统疾病。纳入同期绝经后骨量减少者114例(骨量减少组)以及同期年龄相符的绝经后非OP女性120例(对照组)。记录研究对象身高、体质量,计算体质量指数(BMI),采用X线骨密度仪测量L1~4(取平均值)、股骨颈处BMD。3组研究对象一般资料差异无统计学意义(P > 0.05,表 1),具有可比性。本研究经过恩施土家族苗族自治州中心医院伦理委员会审核备案。

表 1 一般资料 Tab. 1 General information
1.2 方法 1.2.1 骨代谢指标测定

3组研究对象均抽取空腹静脉血5 mL,离心得上清液,采用酶联免疫法测定血清OCN、β-CTX、PINP水平。OCN ELISA试剂盒(ml058528)、人β-CTX ELISA试剂盒(ml038555)和人PINP ELISA试剂盒(ml038554)均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2.2 沉默前成骨细胞中的lncRNA WT1-AS的表达

小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1购自中国科学院细胞库。MC3T3-E1细胞培养在质量浓度为0.10 g/mL的胎牛血清和质量浓度为0.01 g/mL的双抗α-MEM中生长,3 d更换一次成骨培养基(含0.10 g/mL FBS,0.10 μmol/L地塞米松,10.00 mmol/L β-甘油磷酸酯,50.00 μmol/L抗坏血酸,60.00 μg/mL青霉素和100.00 μg/mL链霉素),在37℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度培养箱中生长,当细胞达到80%融合,使用胰蛋白酶将细胞消化传代,取对数生长期细胞,使用Lipofectamine 2000转染试剂将siRNA和lncRNA WT1-AS siRNA转染至细胞中,转染48 h,并记为siRNA组和lncRNA WT1-AS siRNA组,并与未转染细胞(未转染组)进行比较。各组细胞继续使用成骨培养基培养,诱导细胞分化14 d,检测成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)的活力水平,ALP检测试剂盒(P0321S)购自上海碧云天生物技术有限公司;使用质量浓度为0.04 g/mL的多聚甲醛固定细胞1 h,然后加入茜素红染液在室温下染色15 min,显微镜下观察钙结节形成情况,加入质量浓度为0.10 g/mL的乙酸提取染色,酶标仪测量562 nm处的吸光度[13]

1.2.3 血清及细胞lncRNA WT1-AS水平测定

提取各组血清及各组细胞总RNA 5 μg,反转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM进行扩增,内参选用GAPDH基因,lncRNA WT1-AS、GAPDH引物序列见表 2,由上海生工生物工程股份有限公司构建。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)条件为:95℃,10 min;40个PCR循环(95℃,10 s;55℃,20 s;72℃,15 s)。2-ΔΔCt法计算lncRNA WT1-AS相对表达量[14]

表 2 qRT-PCR引物序列 Tab. 2 qRT-PCR primer sequences
1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析,符合正态分布的计量资料以x±s表示,多组间比较采用F检验,进一步比较采用SNK-Q检验;采用Pearson法分析OP患者血清lncRNA WT1-AS水平与BMD及骨代谢指标相关性;采用logistic回归法分析影响OP发生的因素;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清lncRNA WT1-AS对OP的诊断价值;以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与对照组和骨量减少组相比,OP组OCN水平降低,β-CTX、PINP水平及lncRNA WT1-AS相对表达量升高,差异均有统计学意义(P < 0.05,表 3)。OP患者血清lncRNA WT1-AS水平与BMD(L1~4和股骨颈)、OCN水平呈负相关(r=-0.542、-0.557、-0.608,表 4),与β-CTX、PINP水平呈正相关(r=0.576、0.595,表 4)。Logistics回归分析结果显示,血清lncRNA WT1-AS水平是影响OP发生的危险因素(比值比为3.158,P < 0.05)。血清lncRNA WT1-AS水平诊断OP的曲线下面积(AUC)为0.796(95%置信区间0.734 ~ 0.857),特异度为92.11%,灵敏度为62.96%(图 1)。

表 3 各组统计指标 Tab. 3 Statistical indicators for each group

表 4 各因子与OP患者血清lncRNA WT1-AS水平的相关性 Tab. 4 Correlation between various factors and serum lncRNA WT1-AS levels in OP patients

图 1 lncRNA WT1-AS对OP的诊断价值 Fig. 1 Diagnostic value of lncRNA WT1-AS for OP

细胞实验结果显示,与未转染组和si RNA组相比,lncRNA WT1-AS si RNA组lncRNA WT1-AS相对表达量降低,ALP活性和相对吸光度升高,钙结节增加,差异均有统计学意义(P < 0.05,表 5图 2),对照组与si RNA组差异无统计学意义(P > 0.05,表 5图 2)。

表 5 沉默lncRNA WT1-AS对成骨细胞分化的影响 Tab. 5 Effects of silencing lncRNA WT1-AS on osteoblast differentiation

图 2 茜素红染色观察钙结节(×100) Fig. 2 Alizarin red staining observation of calcium nodules(×100) a:未转染组  b:siRNA组  c:lncRNA WT1-AS siRNA组 a: Non-transfected group b: siRNA group c: lncRNA WT1-AS siRNA group
3 讨论

OP是骨代谢异常造成骨流失、BMD降低的疾病。骨吸收与骨形成的失衡是OP发生的重要原因[15]。绝经后妇女由于激素水平异常,会影响骨吸收与骨形成间的平衡,OP发生率较高。BMD检测是临床判定骨质疏松的重要方法,但BMD改变具有滞后性,无法为早期OP的判定提供帮助[3]。骨代谢是骨吸收与骨形成的基础,OCN主要由成骨细胞合成,可调节骨代谢,对OP的诊断具有重要价值;β-CTX可反映破骨细胞骨吸收的程度;PINP可作为检测骨胶原合成情况的指标[16]。本研究基于BMD、OCN、β-CTX、PINP与OP的密切关系,寻找与OP密切相关的分子生物学指标,为早期预测OP的发生提供依据。

lncRNA参与多种生物学过程,近年来关于lncRNA在骨代谢中的研究逐渐增多。史正亮等[5]的研究显示,lncRNA ANCR可刺激OP大鼠脂肪原型干细胞的成骨分化,机制可能为参与对Wnt信号通路的调控。Zhang等[17]的研究显示,lncRNA XIXT靶向作用于骨髓间充质干细胞促进成骨分化,缓解OP进展。lncRNA WT1-AS可编码锌指结构域,在恶性肿瘤中对其研究较多[18-19],在骨代谢中对其研究较少。Wang等[11]的研究显示,lncRNA WT1-AS可与p53相互作用调节成骨细胞的凋亡,表现为OP患者中上调。lncRNA WT1-AS可参与对转化生长因子-β1(TGF-β1)的调控[20],而TGF-β1在骨组织中含量丰富,可促进骨细胞分化[21]。Wu等[7]的研究显示,lncRNA WT1-AS可参与对PI3K/akt通路的调控、促进非小细胞肺癌的进展,而PI3K/akt在调控成骨细胞分化中同样发挥作用[22-23]。本研究中,OP组血清lncRNA WT1-AS水平显著高于骨量减少组和对照组,且骨量减少组与对照组间lncRNA WT1-AS水平也有差异,提示lncRNA WT1-AS水平可能与OP的进展有关。为进一步分析血清lncRNA WT1-AS水平与OP的关系,本研究对OP组血清lncRNA WT1-AS水平与BMD、OCN、β-CTX、PINP水平的相关性进行了分析,发现lncRNA WT1-AS水平与BMD呈负相关,且lncRNA WT1-AS水平与OCN水平呈负相关,与β-CTX、PINP水平呈正相关,提示lncRNA WT1-AS可能与骨形成降低及骨吸收增强有关,即lncRNA WT1-AS可能通过参与对骨吸收、骨形成的平衡调控影响OP进展。本研究ROC曲线分析结果显示lncRNA WT1-AS对OP具有一定的诊断价值,且体内细胞实验结果显示,沉默lncRNA WT1-AS表达能促进前成骨细胞分化和矿化,提示lncRNA WT1-AS可能参与OP的进展,lncRNA WT1-AS有望成为OP治疗的作用靶点。

综上所述,OP患者血清lncRNA WT1-AS水平异常升高,与患者BMD下降及骨代谢指标改变密切相关,对OP具有一定的诊断价值。但本研究也存在一定不足,仅从临床样本中分析了血清lncRNA WT1-AS与BMD和骨代谢指标的相关性,初步通过细胞实验验证lncRNA WT1-AS在成骨细胞中的作用;且骨赘的形成可能对BMD的测定结果产生一定影响,造成数据偏移。未来,本研究组将继续通过体外细胞实验和体内动物实验分析lncRNA WT1-AS对OP相关通路的调控及与OP发生机制的关系。

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