2024, Vol.22 
Issue(4): 233-238
2. 海军军医大学长征医院骨科, 上海 200003;
3. 海军军医大学长征医院急诊重症医学科, 上海 200003
2. Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Naval Medical University, Shanghai 200003, China;
3. Department of Emergency and Critical Care, Changzheng Hospital, Naval Medical University, Shanghai 200003, China
后纵韧带骨化症（OPLL）是一种好发于亚洲人群的脊柱疾病，是涉及后纵韧带的异位骨化[1-2]。OPLL发生隐匿，早期无任何症状，骨化的韧带会逐渐增大，压迫脊髓和神经时才会出现相关症状，此时轻微的碰撞就有瘫痪的风险[3]。OPLL尚无任何有效的非手术治疗手段，手术往往是患者的唯一选择，但是手术难度大，花费高，手术并发症多[4]。OPLL发生机制的研究是OPLL药物治疗和预防性干预策略的关键[5-6]。
神经系统和骨骼系统之间存在物理和功能上的联系[7]。完整的神经支配负责骨的正常发育，而在病理情况下，神经会影响骨的形成和修复[8-9]。神经系统损伤是引发异位骨化的重要因素，有5% ~ 20%颅脑损伤和15% ~ 30%脊髓损伤患者发生异位骨化[10-11]。背根神经节（DRG）中的神经元是一种感觉神经元，有研究[12-14]发现，DRG中的神经元细胞能够调控成骨的过程，DRG中的神经元能够直接传递信号至骨组织，并且影响骨组织中成骨细胞、破骨细胞、间充质干细胞等细胞生理过程，进一步调控成骨过程。有研究[15]表明，DRG中的神经元能够分泌肽基脯氨酰顺反异构酶D（CYP40），下调破骨细胞表面受体，影响破骨细胞形成，调控成骨。最近有研究[16-17]表明，DRG中的神经元同时能够影响脊柱椎间盘的稳态，后纵韧带紧贴在椎体后缘，DRG中的神经元释放的物质能够到达韧带。
有研究[18-22]表明，细胞外囊泡（EVs）是细胞以进化保守的方式释放的含膜囊泡，是一种重要的功能性物质，对许多疾病的发生机制都有影响。50 ~ 200 nm大小的小细胞外囊泡（sEVs）被认为是细胞间信号转导的重要介质[23-24]。sEVs能够运输不同的生物大分子（如蛋白质、脂类、核酸和糖），甚至可以将分子传递到远离分子来源的部位，sEVs通过运输这些具有不同功能的分子到不同细胞帮助细胞之间完成信号转导和生理病理过程[19, 25-26]。有研究[27-28]显示，sEVs可通过调控细胞外基质的形成来促进骨形成。Xu等[29]的研究发现，sEVs的清除剂能够抑制小鼠OPLL的发生、发展。本研究为明确DRG中感觉神经元释放的sEVs对脊柱后纵韧带异位骨化的影响，对此进行了初步的探索。
1 材料和方法 1.1 原代后纵韧带细胞的提取采用手术过程中获取的颈椎OPLL患者（表 1）的韧带组织。所有患者在手术前均签署了知情同意书，本研究经海军军医大学伦理委员会审核备案。按照Tanno等[30]的方法，立刻将韧带组织送往实验室，使用含有抗生素的PBS冲洗去除血迹，然后在无菌操作台中将组织块剪碎放入培养皿，使用含有体积分数为1%的抗生素和体积分数为20%的胎牛血清的DMEM培养基培养，等原代细胞密度达到90%左右进行传代培养。
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表 1 患者一般资料 Tab. 1 General information |
细胞免疫荧光染色检验：在超净台中，将玻璃爬片铺在12孔板中，然后将原代细胞接种在孔板中，待细胞贴壁生长后取出盖玻片，PBS清洗2 ~ 3次。使用体积分数为4%的多聚甲醛固定15 ~ 30 min，用PBS清洗2 ~ 3次。对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。使用封闭液封闭细胞30 min，一抗稀释后将一抗Vimentin（1∶500，Abcam公司，美国）均匀孵育在玻璃爬片表面，并在4℃冰箱中孵育过夜。过夜后使用PBS清洗2 ~ 3次。使用荧光二抗室温避光孵育1 ~ 2 h，使用PBS清洗3次。使用含DAPI的封片剂，每个爬片滴1滴，然后将爬片翻转贴在载玻片上，使用荧光显微镜观察并拍摄。
1.2 sEVs的提取DRG神经元细胞（Cat NO.CP-M166）购于武汉普诺赛公司，将细胞接种在培养瓶中，当密度达到100%时使用无外泌体培养基进行培养，24 h后收集上清液，3 000×g（g=9.806 65 m/s2）、4℃离心10 min，去除细胞碎片，取上清液至新离心管中；10 000×g、4℃离心10 min，进一步去除细胞碎片，取上清液至新离心管中；100 000×g、4℃离心90 min，弃去上清液，加入30 mL预冷的PBS重悬沉淀；100 000×g、4℃离心90 min，弃去上清液，用微量PBS（约200 μL）重悬沉淀，得到sEVs。
1.3 sEVs的鉴定纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测：取30 μL sEVs原液稀释至1 mL，采用NTA仪进行粒径检测。
蛋白质印迹检测：使用裂解液提取总蛋白，收集裂解液混合物，13 400×g、4℃离心20 min后收集上清液。蛋白定量检测采取BCA法：使用电泳上样缓冲液配平后高温煮沸样品，取15 μg蛋白进行电泳，然后转膜、封闭、孵育一抗：CD9（1∶1 000，Abcam公司，美国），HSP70（1∶1 000，Abcam公司，美国），TSG101（1∶1 000，Abcam公司，美国）。4℃过夜后，室温孵育二抗。最后使用化学发光试剂盒和成像系统检测蛋白条带。
透射电镜检测：sEVs原液用体积分数为2.5%的戊二醛溶液4℃固定过夜，取5 ~ 10 μL sEVs原液滴到铜网上，室温静置5 min，用滤纸吸除液体。在铜网上滴加染色液（饱和醋酸双氧铀溶液）染色1 min，用滤纸吸除液体。在铜网上滴加ddH2O，室温静置5 min，用滤纸吸除液体；重复1次。室温干燥，电镜观察、拍照。
1.4 韧带细胞和sEVs共培养在96孔板中每孔加入含有2 000个韧带细胞的100 μL细胞培养液，其中48孔作为对照组、另48孔加入分离提纯sEVs原液5 μL作为实验组。每孔加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1 h，使用酶标仪检测450 nm处的光密度（OD）值。
1.5 sEVs成骨诱导分化检测使用成骨诱导分化试剂盒（G3281，Solarbio公司，中国）诱导对照组和实验组细胞成骨分化21 d，按照说明书进行茜素红染色（ARS）、碱性磷酸酶（ALP）染色。分别在450 nm和570 nm处测定OD值并进行定量分析。
1.6 成骨标志物runt相关转录因子2（RUNX2）和骨钙素（OCN）的表达细胞免疫荧光染色：在超净台中，将玻璃爬片铺在12孔板中，然后将对照组细胞和培养2 d的实验组细胞接种在孔板中，待细胞贴壁生长后取出盖玻片，PBS清洗2 ~ 3次。使用体积分数为4%的多聚甲醛固定15 ~ 30 min，用PBS清洗2 ~ 3次。对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。使用封闭液封闭细胞30 min，一抗稀释后将抗体RUNX2（Abcam公司，1∶500，美国）、OCN（Abcam公司，1∶500，美国）均匀孵育在玻璃爬片表面，并在4℃冰箱中孵育过夜。过夜后使用PBS清洗2 ~ 3次。使用荧光二抗室温避光孵育1 ~ 2 h，使用PBS清洗3次。使用含DAPI的封片剂，每个爬片滴1滴，然后将爬片翻转贴在载玻片上，使用荧光显微镜观察并拍摄。使用Image J软件对相对荧光强度进行定量分析。
实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）：采用总RNA提取试剂盒（DP419，天根生化科技北京有限公司，中国）提取2组细胞总RNA，测定浓度后取2 μg RNA添加到反转录体系中合成样本cDNA。随后配制20 μL的反应体系，包含cDNA模板、目的基因特异性PCR引物、灭菌水和TB Green® Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒（RR820A）。PCR反应条件：95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 10 s、72℃ 25 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
1.7 统计学处理采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 原代韧带细胞的提取和鉴定提取的原代细胞外形呈梭形或纺锤形，细胞核呈圆形或椭圆形，贴壁生长。免疫荧光染色结果显示成纤维细胞标志物波形蛋白阳性，证实来源于后纵韧带的原代细胞是典型的成纤维细胞（图 1）。
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图 1 成纤维细胞标志物波形蛋白免疫荧光染色 Fig. 1 Immunofluorescence staining of fibroblast biomarkers vimentin |
NTA检测结果显示提取的sEVs直径约110 nm（图 2a）。蛋白质印迹检测发现sEVs标志物HSP70、TSG101和CD9的表达（图 2b）。透射电镜观察到提取的sEVs有清晰的膜结构，分布均匀不聚集，外形呈茶托状或杯状结构，边缘清晰（图 2c~e）。以上结果显示提取的sEVs大小、形态和表面标志物都符合sEVs标准。
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图 2 sEVs的提取和鉴定 Fig. 2 Extraction and identification of sEVs a：sEVs直径 b：sEVs标志物蛋白表达 c ~ e：sEVs形态 a: Diameter of sEVs b: Protein expression of sEVs marker c-e: Morphology of sEVs |
共培养结果显示，与对照组相比，实验组48 h时韧带细胞的增殖活性明显上升（图 3）。
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图 3 CCK8检测韧带细胞的活性 Fig. 3 CCK8 detection of ligament cell activity 注：*与对照组比较，P < 0.05；n=3。 Note: * P < 0.05, compared with control group; n=3. |
ALP染色、ARS及定量分析结果显示，与对照组相比，实验组细胞成骨分化程度明显上升（图 4）。
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图 4 成骨诱导分化检测
Fig. 4 Osteogenesis induced differentiation detection
注：*与对照组比较，P < 0.05；n=3。 a、b：ALP染色及定量分析 c、d：ARS及定量分析 Note: * P < 0.05, compared with control group; n=3. a, b: ALP staining and quantitative analysis c, d: ARS and quantitative analysis |
细胞免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，实验组细胞胞质和细胞核中成骨标志物RUNX2和OCN的表达均明显增加（图 5a、b）。实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，实验组韧带细胞中RUNX2和OCN的mRNA水平也明显增加（图 5c）。
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图 5 成骨标志物检测
Fig. 5 Osteogenic markers detection
注：*与对照组比较，P < 0.05；n=3。 a：免疫荧光染色 b：平均荧光强度检测定量分析 c：PCR检测定量分析 Note: * P < 0.05, compared with control group; n=3. a: Immunofluorescence staining B: Quantitative analysis of mean fluorescence intensity c: Quantitative analysis of PCR detection |
目前，OPLL的发生率逐年上升，OPLL发生隐匿，出现症状时往往骨化物已经压迫脊髓，此时轻微的压迫可能引起严重的后果。由于OPLL的发生机制尚未阐明，OPLL缺乏非手术治疗的手段，尤其是药物治疗，手术是有症状患者的唯一选择，但术后仍存在再发骨化的风险[5-6, 31]。
感觉神经元在骨稳态中发挥着关键的作用。骨骼中存在丰富的神经支配，这些感觉神经支配骨膜，穿过矿化骨终止于骨髓[32]。DRG同样与韧带存在紧密的联系，韧带中存在大量与中枢神经系统相通的机械感受器，能够将机械变形以电信号的方式传递到DRG[33-34]。此外，这些机械感受器不仅能够传递动态刺激，还可传递压力、拉伸等信号[35]。拉伸、应力刺激是引发OPLL的重要因素，脊柱后柱的不稳能够导致骨化的后纵韧带短时间内骨化迅速进展[36]，并且应力刺激能够促进细胞外信号激活各种激酶，促进韧带细胞的成骨分化[37]。应力还能够通过影响内质网应激促进骨化，力学加载后的骨化韧带细胞中的应激标志物表达进一步上升，进一步促进韧带细胞骨化[38]。
本研究结果显示，DRG中的神经元能够释放sEVs，这些sEVs能够促进骨化韧带细胞体外的增殖和成骨分化，提示神经-成骨网络与OPLL的发生、发展存在一定的联系。过度应力刺激可能会异常激活韧带中的机械感受器，这些异常的信号传递到DRG后促进感觉神经元释放sEVs。除此之外，感觉神经元中的sEVs能够运输多种生物分子，如miRNA、LncRNA和CircRNA等[40-41]，这些分子能够影响后纵韧带细胞的信号转导，从而诱发骨化。sEVs里的物质及其如何影响OPLL值得进一步探索。本研究是一项初步研究，存在着许多不足，比如缺乏对sEVs体外促进后纵韧带细胞骨化的机制研究及实验动物的体内验证，这也是本研究组未来的研究方向，同时也希望本研究的初步结论能够给其他研究人员带来一定的启发。
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